[发明专利]一种用于治疗鸭病毒性疾病的鸭白细胞干扰素

说明书

技术领域

本发明属于兽药技术领域，涉及一种治疗鸭病毒性疾病的鸭白细胞干扰素的制备方法及其抗病毒活性的测定。

背景技术

随着国民经济的飞速发展及农业结构的科学调整，养鸭业成了畜牧业发展速度很快的一个产业。在养鸭业迅速发展的大好背景下，鸭的流动性大大增加，鸭的集约化生产程度进一步提高，鸭疾病对鸭生产所造成的影响变得越来越突出。如何有效防治鸭疾病、减少经济损失，成为大家非常关心的问题之一。目前，主要是以防疫为手段来控制鸭病毒性疾病的发生。近年来各方面的研究发现，干扰素(病毒的干扰作用是由一种物质引起的，该物质称之为干扰素)具有抗病毒作用外，还具有抗肿瘤作用，对免疫系统的调节作用和抗细胞等一系列的生理活性，但在兽医学领域，动物干扰素未能被广泛应用，主要原因在于目前所获得的动物干扰素安全性不高，制造工艺复杂，成本高，售价昂贵，效果不显著，推广受到限制。

本发明目的是旨在克服上述缺点，提供一种治疗鸭病毒性疾病的鸭白细胞干扰素。该鸭白细胞干扰素作为一种广谱抗病毒药物，用于治疗鸭瘟、鸭病毒性肝炎、鸭源性新城疫、鸭源性减蛋综合症等疾病。

干扰素抗病毒具有以下特点：

1、干扰素抗病毒不是杀灭而是抑制病毒，一旦撤去干扰素，病毒往往又重新繁殖。只有用足够浓度的干扰素，长期使用，才有可能将其彻底消灭。因此干扰素需要长期使用治疗。

2、干扰素具有种属特异性，人干扰素一般只用于治疗人的疾病。因此要对抗鸭病毒病就要制备鸭干扰素。

3、不同的细胞种类和不同的动物、不同的病毒感染类型对干扰素的敏感性不同。因此，类型不同的干扰素临床效果也有所不同。

关于干扰素的研究报道很多，其制备方法已日渐成熟，但由于干扰素具有种属特异性，针对不同的物种要用相应的干扰素来治疗效果最好。同时不同的细胞种类和不同的动物、不同的病毒感染类型对干扰素的敏感性不同。因此，类型不同的干扰素临床效果也有所不同。要对抗鸭病毒性疾病就要制备鸭干扰素。目前还未见有关利用鸭血制备鸭白细胞干扰素的报道。

因此，提供一种有效预防和治疗鸭病毒性疾病的鸭白细胞干扰素的制备方法，是该技术领域科研人员急需开发的新课题之一。

发明内容

本发明的目的在于在现有技术的基础上改进，提供一种鸭白细胞干扰素的制备方法。

为实现上述目的本发明所采用的实施方式如下：

一种鸭白细胞干扰素的制备及其抗病毒活性的测定方法，其特征在于具体实施步骤如下：

(1)制备鸭血清：无菌采集鸭血，4℃冰箱放置，自然析出，用0.2％CaCl₂处理血浆，除去纤维蛋白，0.22μm过滤除菌，置-20℃保存备用；

(2)制备白细胞：无菌采集健康鸭血，加入100μg/ml双抗和适量枸橼酸抗凝剂，4℃冰箱放置；以4000rpm离心30min，收集中层白细胞，灰黄层，用PBS清洗再次离心分离，收集沉淀白细胞，用加了100μg/ml双抗及上述鸭血清的DMEM培养液稀释白细胞沉淀物，使白细胞浓度稀释为1×10⁶/ml；

(3)白细胞悬液中加入效价高的人白细胞干扰素作为启动干扰素，使培养液中含干扰素抗病毒活性100～500单位/ml，于37℃水浴搅拌培养3～4h；

(4)在启动的白细胞悬液中加入适量诱生剂鸭源性新城疫病毒(用前在9日龄鸭胚中扩增并测定血凝效价为1∶1280)，使其最终浓度为320血凝单位/ml，37℃水浴摇床培养18～24h；

(5)待干扰素达到最高峰时，离心收集上清，加入盐酸调至pH2.0～3.0，4℃，放置3～5天，灭活病毒，再加NaHCO₃调至pH7.0～8.0，无菌4℃离心4000rpm30min，收集上清干扰素，除去沉淀及杂质，即得粗制鸭白细胞干扰素；

(6)鸭白细胞干扰素抗病毒活性检测，主要步骤是：10日龄SPF鸭胚去掉四肢、头部及内脏，加2倍体积胰酶消化，37℃消化10min左右，等成絮状时倒掉胰酶，加入DMEM培养基反复吹打，制备DEF，吹打均匀后过滤，取一滴滤液在细胞记数板查看细胞密度，以1×10⁴cells/空密度将DEF铺于96孔板，每孔100μl，待细胞长成单层后，加入10倍梯度稀释的鸭白细胞干扰素，37℃、CO₂，作用24h左右，接VSV病毒1000TCID₅₀，37℃、CO₂，培养24h左右，镜检阳性对照孔有75％病变，加鸭白细胞干扰素孔有达到及小于50％时，记录结果。