[发明专利]一种培育高α-生育酚大豆的方法

说明书

【技术领域】：

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及到一种培育高α-生育酚大豆的方法，该方法能将野生型大豆中原来占优势形式的γ-生育酚全部转化成α-生育酚。

【背景技术】：

维生素E是一类人体所必需的脂溶性维生素，为维持人体正常生理功能所必需。它能够清除脂质过氧化所产生的自由基而稳定保护生物膜的磷脂双分子层，使细胞免受过氧化物的伤害。因而作为一种抗氧化剂能延缓衰老，维持肌肉、中枢神经系统和血管正常代谢，临床上可用来治疗与预防高血压、冠心病、心肌梗塞、动脉硬化、血栓、不孕症、癌症等疾病。

维生素E的生产可通过化学合成和天然提取来获得。化学合成的产品主要以醋酸脂的形式存在，副产物多且生物活性低。随着生活水平的提高，人们对健康越来越重视，世界范围内对天然维生素E的需求在不断增长。天然维生素E仅由植物和某些光合细菌所合成。生育酚的分布非常广泛，几乎存在于所有植物的叶片和种子中，而生育三烯酚的分布却非常有限，仅存在于禾本科等少数植物的种子中。在4种生育酚中，α-生育酚活性最高，是人体优先吸收和利用的形式，因为人体中具有优先结合α-生育酚的α-生育酚结合蛋白(α-TTP)，而β、γ、δ-生育酚的活性分别是α-生育酚的50％、10％和3％。不同植物组织中生育酚的组成和含量不尽相同。在绿色的植物组织中，α-生育酚是含量最丰富的生育酚，但这些组织中的总生育酚水平却很低(10-50μg/g鲜重)。与光合组织不同，植物的非绿色组织如大多数油料作物的种子，常含有高浓度的总生育酚(500-2000μg/g鲜重)。然而这些种子中，活性最高的α-生育酚含量很低，如豆油中，活性最高的α-生育酚含量仅占7～10％，而活性很低的前体形式γ-生育酚含量却高达70％以上，导致维生素E总体活性很低。

植物维生素E代谢合成途径提示，γ-生育酚甲基化酶是催化γ-生育酚转化成α-生育酚的主要酶，该酶在野生型植物种子中的表达受到抑制。将编码γ-生育酚甲基化酶的基因与植物种子特异性表达启动子连接构建成植物表达载体，然后转化大豆，可提高大豆种子中α-生育酚的含量，提高其营养价值，该领域已成为VE代谢工程研究的一个热点，具有重要的应用价值。这一设想虽然在理论上可行，但尚未见有培育高α-生育酚大豆方法的报道，特别是针对环渤海地区主栽的高油品种更未见报道。

【发明内容】：

本发明的目的是提供一种培育高α-生育酚大豆的方法。

本发明所述的培育高α-生育酚大豆的方法，涉及从甘蓝型油菜中分离的γ-生育酚甲基转移酶基因，核苷酸长度为1044bp，编码347个氨基酸。

本发明所述的培育高α-生育酚大豆的方法，涉及将甘蓝型油菜γ-生育酚甲基转移酶基因(GenBank登陆号为DQ508019)与pG1、pFAE1等种子特异性启动子进行功能性组合构建成植物表达载体；然后再将带有γ-生育酚甲基转移酶基因的植物表达载体通过农杆菌介导的方法感染大豆胚尖，经含50mg/L卡那霉素培养基连续抗性筛选获得再生芽及植株。

采用本发明的方法培育高α-生育酚大豆，具有取材方便，转化效率高，培养周期短(2个月左右即可获得转基因植物)，操作简单，移栽成活率高的特点，且转基因大豆中原有的γ-生育酚全部转化为α-生育酚。该法同样适用于其他油料作物维生素E成分的改造。

本发明的优点和积极效果：

采用本发明提供的利用甘蓝型油菜γ-生育酚甲基转移酶基因的种子特异性表达载体培育高α-生育酚大豆，具有取材方便，转化效率高，培养周期短(2个月左右即可获得转基因植物)，操作简单，移栽成活率高的特点，且转基因大豆原有的γ-生育酚全部转化为α-生育酚，而普通大豆中α-生育酚含量仅占生育酚总量的7-10％。该法同样适用于其他油料作物维生素E成分的改造。

【附图说明】：

图1是植物表达载体的示意图。pG1：G1启动子；γ-TMT：γ-生育酚甲基转移酶基因；UTT和Nos-T：转录终止序列；NPT II：新霉素磷酸转移酶基因。

图2是大豆胚尖植株再生体系。A胚尖培养在6-BA浓度为3.5mg/的培养基上；B培养24h后的胚尖；C胚尖再生出不定芽；D不定芽生长成的小苗。

图3是转γ-TMT大豆在卡那霉素培养基上的抗性筛选。

图4是转γ-TMT大豆抗性植株的PCR鉴定。M：DNA分子量标准(bp)；1空白对照2，3：转基因植株；4，8：野生型植株对照；5：γ-TMT质粒；6，7：转基因植株；9：FAE1质粒。

图5是移栽成活的转基因大豆。

【具体实施方式】