[发明专利]一种采用双水相体系从原发酵液中提取聚谷氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种聚氨基酸的分离纯化技术，更具体的说是涉及一种采用双水相体系从原发酵液中提取聚谷氨酸的方法。

背景技术

聚氨基酸类物质，如聚谷氨酸[γ-polyglutamic acid，以下简称γ-PGA]是微生物合成的一种水溶性的高分子，通常由5000个左右谷氨酸单体组成，相对分子质量一般在10万～100万之间。由于其发酵液具有粘稠特性，造成聚谷氨酸和菌体的分离难当困难，通常的分离提取方法都收不到理想的效果，提取效率只有40-50％，产品的纯度仅有30-40％。

双水相(Aqueous two-phase system，简称ATPS)萃取技术，是近年出现的一种极具应用前途的新型生物化工分离技术。它是由两种化学结构不同的亲水性聚合物，或一种亲水性聚合物和无机盐，在水中以适当的浓度形成互不相溶的两相，利用待分离组分在两相间分配的差异，从而达到物质分离提纯的目的。ATPS具有生物相容性高、单级分离提纯效率高、溶质分配过程温和、与其它技术间相互集成性强、能进行萃取性的生物转化、操作容易、能够精确地按比例放大、对环境污染小、成相物质可回收等特点。

成功利用双水相萃取技术分离聚谷氨酸的关键是寻找合适的双水相体系和寻找合适的萃取条件，包括系统条件和环境条件。目前在生化工程中应用最广泛的两种双水相体系是聚合物/聚合物体系、聚合物/盐体系，聚乙二醇/葡聚糖、聚乙二醇/磷酸盐或聚乙二醇/硫酸盐是这两者的代表。

在本实验室既往的研究中，王雷、李楠等人采用分子量为1500的聚乙二醇与磷酸盐组成双水相体系对除茵后的发酵液进行聚谷氨酸的分离，经过自然分相，聚谷氨酸的分配系数为31.7，上相收率为96.8％，分离提取产品纯度为81％。该方法由于发酵生产使用的菌体为纳豆芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌，菌体细小，在实际生产的离心除菌操作时需要使用转速为12000-15000r/m以上高速连续排渣或间歇式离心机，而此种离心机的造价昂贵，设备投资大。再有，从整个生产周期来考虑，采用离心除菌和自然分相工艺所需的处理时间较长，致使生产周期延长。

发明内容

本发明是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种高效、简便、降低生产成本的采用双水相体系从原发酵液中提取聚谷氨酸的方法。

本发明通过下述技术方案实现：

一种采用双水相体系从原发酵液中提取聚谷氨酸的方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)在常温下，将平均分子量为1000的聚乙二醇溶液、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液、未除菌的原发酵液和水制成混合溶液，其中，平均分子量为1000的聚乙二醇(PEG1000)的质量百分含量为23％，磷酸盐的质量百分含量为23％，未除菌的原发酵液的质量百分含量为10％，余量的水；

(2)将上述混合溶液在3000r/min条件下离心5分钟分相。经离心后菌体被分离到容器的底部，而上相与下相清楚地得到分离。分别测定上相、下相中聚谷氨酸的含量，通过上下相中聚谷氨酸的浓度计算出双水相萃取的分配系数，然后根据上下相的体积计算出上下相中聚谷氨酸的提取率，综合分配系数和提取率。分配系数和提取率越高，体系的分配效果越好。

(3)取上相，用截留分子量为6000的超滤膜回收聚乙二醇，得到聚谷氨酸浓缩液，将聚谷氨酸浓缩液冷冻干燥得到聚谷氨酸粉末。

所述磷酸盐为磷酸钠钾盐。

平均分子量为1000的聚乙二醇溶液的质量分数为50％，磷酸盐缓冲液的质量分数为30％。

本发明具有下述技术效果：

1.本发明的方法采用PEG1000与磷酸盐组成双水相体系对未经除菌的原发酵液直接进行聚谷氨酸的分离纯化，可使除菌和分离提取聚谷氨酸一步完成，从而缩短了提取时间和生产周期，降低了生产成本，并节省了高速离心设备的投资，分离纯化方法简便、高效。而且，分离效果更好，提取率更高，纯度更高，可节省设备的投入费用和降低生产成本。

2.本发明的方法采用离心操作，既能达到除菌的目的，又能达到分相的目的，一举两得。

3.本发明的方法利用膜分离技术浓缩料液，还可以同时回收聚乙二醇，经过简单处理后可重复使用，从而节省了双水相试剂的用量，降低了生产成本。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明详细说明。

实施例1