[发明专利]重组β-内酰胺酶与RGD融合蛋白及其在医学中的应用

说明书

技术领域

本发明属于抗体导向酶-前药疗法(ADEPT)技术领域，更具体的说是 一种重组β-内酰胺酶与RGD融合蛋白及其在治疗乳腺癌中的应用。

背景技术

高选择性肿瘤化疗是目前肿瘤研究的重要课题之一，大多数化疗药物 缺乏对肿瘤组织的高选择性，往往在对肿瘤组织发挥作用的同时也对身体 的正常组织产生毒副作用。单克隆抗体技术问世以来，为肿瘤的导向治疗 提供了基础。前药是一类本身无活性或活性很低，但在体内可转化为活性 物质的药物。利用抗体做为载体携带前药的专一性活化酶，可以选择性地 结合于肿瘤部位，使前药可以区域特异性在肿瘤组织内转化为活性细胞毒 分子，这种方法被称为“抗体导向酶-前药疗法(antibody-directed enzyme prodrug therapy，ADEPT)。自1987年Bagshawe提出ADEPT这 一概念，已引起了人们的广泛的关注，他克服了以往化学免疫偶联物和免 疫毒素存在的许多问题。Bagshawe从绿脓杆菌中分离羧肽酶G2并且克隆 入人大肠杆菌中，最初是用来降解甲氨蝶呤，后来用来切除苯甲酸氮芥的 衍生物上谷氨酸部分使之活化。这是目前最具代表性的一套ADEPT系统， 而且已进入小规模临床试验阶段。只需要少量的酶-抗体交联物就可以在 肿瘤部位催化大量的前体药物变为有毒性作用的活性药物。ADEPT方案的 优势在于一个酶分子可以转化很多个分子的前体药物，在肿瘤部位产生高 浓度的活性药物，这样可以弥补临床应用中免疫联物结合力较低的缺点， 另有证据表明，在肿瘤表面产生高浓度药物比全身应用同等浓度的活性药 物更加有效。

β-内酰胺酶是由抗生素处理过的耐药菌株产生的一类外源性酶。内 酰胺类的药物用于治疗细菌感染已经在临床上使用很多年了。β-内酰胺 类化合物对人体的毒性很低，而且不会被人体内源性的酶水解。而且，β -内酰胺酶是一个单链的蛋白，分子量相对较小，性质稳定且易于纯化。 一种β-内酰胺酶的突变体具有更好的免疫学性质，更适用于ADEPT。将β -内酰胺酶融合到一段单链抗体后，能够富集于肿瘤部位，在血浆很快的 清除。β-内酰胺酶可以激活一系列化疗药的前药，而且，作为一种可溶 性蛋白，β-内酰胺酶可以在大肠杆菌中量产，便于今后临床使用。

细胞与细胞外基质或细胞培养的支架材料等的粘附是细胞生存与增 殖所必需的，这种粘附主要通过一种被称为整合素的物质来介导。癌细胞 表面的整合素与正常组织粘连，造成癌转移。整合素分子最重要的识别序 列是蛋白质中的Arg-Gly-Asp(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸，简称RGD) 序列，大多数整合素都可识别它。所以如果ADEPT中的β-内酰胺酶与RGD 序列进行融合表达，它就可以特异性的将β-内酰胺酶定位于癌细胞表面， 特异性的在癌细胞表面对前药进行活化，从而发挥抗肿瘤作用。

发明内容：

本发明的一个目的是克服现有技术的不足之处，提供一种具有细胞粘 附活性的β-内酰胺酶-RGD融合蛋白及其编码的多核苷酸。特别是具有 RGD4C：Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly的β-内酰胺酶 -RGD4C融合蛋白。

本发明的另一个目的是提供β-内酰胺酶-RGD融合蛋白在乳腺癌药 物治疗中的应用。

本发明提供的β-内酰胺酶-RGD融合蛋白，它的氨基酸序列包含了 源于β-内酰胺酶的序列以及含短肽RGD的序列。为此，本发明提供了如 下的技术方案：

一种β-内酰胺酶-RGD融合蛋白，其所具有的氨基酸序列如下：