[发明专利]中国林蛙皮cDNA文库

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域及生物制药领域，具体涉及一种中国林蛙皮cDNA文库及其构建方法，并涉及从所构建的cDNA文库中筛选具有抗临床多重耐药菌活性的抗菌肽基因。

背景技术

人类与环境微生物的抗争一直持续在人类进化过程之中，1941年开始的青霉素的临床使用加剧了人与环境微生物的拮抗。近半个多世纪以来，微生物耐药性突变株的产生与新型抗菌剂的发现一直吸引着人们的注意，这关乎着人类的健康与环境的和谐。

自从二十世纪八十年代瑞典科学家Boman HG.等人从惜古比天蚕(Hyatophora cecropia)蛹中诱导分离得到杀菌肽(bactericidal proteins)，命名为cecropin后，每年都有多种抗菌肽被分离、纯化。抗菌肽具有分子量小、热稳定性好、水溶性好、抗菌谱广以及材料来源丰富等特点。抗菌肽的来源复杂多样，从植物到动物甚至人体组织，都分离、纯化得到过抗菌肽。其中两栖类动物生存环境复杂多样，它们的皮肤在维持生存、开拓和适应广阔栖息地中起着重要作用。为了适应生存环境，两栖类的皮肤中分布了种类繁多、功能复杂的活性物质，是一个巨大的活性生物分子资源库和药物资源库，使得两栖类的皮肤成为人们分离抗菌肽的一大研究热点。继1987年Zasloff.M课题组从非洲爪蟾Xenopus laevis皮肤中分离出magainins后，每年都有大量的抗菌肽从两栖纲无尾目类动物(青蛙和蟾蜍)的皮肤中获得。抗菌肽在最低抑菌浓度(MIC)下对细菌质膜的破坏作用被认为是抗菌肽主要的抗菌机理，但是在实际研究中人们发现部分抗菌肽种类可以跨菌膜存在，并且进一步抑制生物大分子的合成，影响部分酶的活性，甚至影响细胞的分化或刺激细胞自动裂解。一般说来，在抗菌肽的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度(MBC)非常接近(小于2倍)的情况下，认为抗菌肽是起到杀菌的作用而非抑菌；相反，如果MIC和MBC浓度比超过两倍则可以认为抗菌肽是起到抑菌作用，多数抗菌肽属于杀菌作用机理。抗菌肽不能够被已知的耐药菌的抗抗生素机制所抑制，这一点已经被部分研究所证实。而且研究表明抗菌肽在微克分子浓度时对肿瘤细胞和病毒都有杀伤作用，但对没有病变的动物细胞没有作用。这是目前使用的各种肿瘤化疗药物所不具备的特性。在目前许多病原菌对现有抗生素逐步产生耐药性，而新的抗生素的发现又极其困难的情况下，抗菌肽为开发新的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。但是，天然抗菌肽在动植物体内含量极微，仅靠提取得到抗菌肽不仅产量低、费时长、工艺复杂，而且花费昂贵，很难实现大规模生产。因此，开展抗菌肽基因工程研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于构建中国林蛙皮的cDNA文库，用以筛选高抗菌活性的抗菌肽。并从中筛选得到具有抗临床多重耐药菌活性的林蛙抗菌肽。为了实现上述目的，采取以下步骤构建cDNA文库：

1、蛙皮中总RNA提取及mRNA纯化

用v-gene纯化试剂盒(v-gene)纯化mRNA，用分光光度法估测总RNA含量和纯度.

2、cDNA合成和重组载体的构建

按universal riboclone cDNA synthesis system操作指南(promega)，以randomhexameric primers为引物，经反转录合成第1链cDNA；再以DNAPolymerase I合成第2链.用T₄DNA连接酶在cDNA的5′端连接EcoR I衔接头，用Not I酶切cDNA，使cDNA的3′末端形成Not I突出末端，以便于将cDNA定向克隆到载体中，酚∶氯仿抽提cDNA。按试剂盒操作说明，以T₄DNA连接酶将cDNA定向连接到不同比例的λphage载体(packagene lambda DNA packaging systempromega)上，以选择最佳连接比例。噬菌体包装、宿主菌(LE392)的感染和文库的扩增等按常规操作。

3、cDNA文库的滴度和重组率的测定

从cDNA文库中取出5μL，按1∶1000、1∶10000的比例稀释，转染宿主菌大肠杆菌(LE392)，铺于含IPTG和X-gal的平板上，培养过夜后，计算噬菌斑的个数，按下面公式推算文库的滴度。

分别记数蓝斑和白斑的个数，计算重组率。

附图说明

图1：cDNA 1％琼脂糖凝胶电泳。

具体实施方式

实施例1：林蛙皮cDNA文库构建方法