[发明专利]人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白制备方法及其在防治奶牛乳房炎中的应用

说明书

技术领域

本发明公开一种人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白，同时还提供了其基因 工程制备方法，本发明进一步提供了该融合蛋白生物制剂在防治奶牛乳房炎中的应 用，属于兽医学生物制药领域。

背景技术

奶牛乳房炎是奶牛最常见、防治最难、花费最多的疾病之一，给奶牛业生产造成 了严重的危害。严重影响牛奶的品质，间接影响人体健康，给奶牛业带来巨大的经济 损失。

目前常用的治疗奶牛乳房炎的药物为抗生素，如环丙沙星、青霉素等，但是由于 抗生素长期使用造成了严重的耐药现象，近几年凝固酶阴性葡萄球菌的比例上升，其 中葡萄球菌的耐药率达90％以上，直接导致乳房炎的治疗效果显著下降。同时，抗生 素在乳中残留严重危害人类健康，如果用含抗生素的奶做酸奶或奶酪等，则残留在其 中的抗生素会抑制细菌的发酵，使产量和质量降低。我国食品卫生法规定，在应用抗 生素期间和停药后5天内的乳不能食用。因此，抗生素的疗效越来越差，应用范围也 受到很大限制。

本发明涉及的人溶菌酶是人体内的一种蛋白质，和人体具有天然相容性，在临床 上应用时，比其它溶菌酶更安全，且没有刺激性和副作用。抗菌肽又叫抗微生物肽， 是哺乳动物防御系统的一个重要组成部分，具有热稳定性好，水溶性好，广谱杀菌的 特点，对较大的离子强度和较低或较高的PH值都有较强的抗性。

近年来虽然有报道克隆人溶菌酶基因进行基因工程表达及探讨转基因小鼠表达 人溶菌酶的研究，也有报道有关抗菌肽基因以及与其它相关基因融合的克隆和表达， 但未见将人溶菌酶和抗菌肽融合表达产物用于治疗奶牛乳房炎的研究，也没有和本项 目相关内容的专利公开。

发明内容

本发明公开一种人溶菌酶-抗菌肽融合蛋白，为一种新的融合蛋白。

本发明还提供了该融合蛋白的制备方法，采用基因工程方法生产生物制剂。

本发明进一步公开了该融合蛋白在制备治疗奶牛乳房炎药物中的用途。

本发明的人溶菌酶-抗菌肽融合蛋白，其特征在于它是由人溶菌酶与抗菌肽 Catesbeianin-1在基因水平融合后表达的重组蛋白：所述的人溶菌酶氨基酸序列如SEQ 1D NO.1所示，抗菌肽氨基酸序列为SEQ 1D NO.2序列所示，连接肽氨基酸序列为 SEQ 1D NO.3序列所示，人溶菌酶与抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白氨基酸序列为SEQ 1D NO.4所示，人溶菌酶与抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白通过人溶菌酶-15个柔性氨 基酸的连接肽-抗菌肽Catesbeianin-1的方式连接。

本发明人溶菌酶-抗菌肽融合蛋白的制备方法包括以下步骤：

1、从人胎盘组织中克隆人溶菌酶基因至pMD18T载体，通过设计引物PCR，获 得人溶菌酶基因；

2、采用人工合成方法获得抗菌肽Catesbeianin-1基因以及连接肽基因；

3、通过酶切连接的方法把人溶菌酶基因，连接肽基因和抗菌肽Catesbeianin-1基 因连接，得到人溶菌酶-连接肽-抗菌肽Catesbeianin-1基因；

4、人溶菌酶-连接肽-抗菌肽Catesbeianin-1基因与经过EcoR1和Xbal 1双酶切的 pPICZαA载体连接，并转化至大肠杆菌DH5α中，通过PCR和双酶切鉴定，筛选阳 性克隆送至上海生物工程测序；

5、将测序正确的重组质粒pPICZαA-hlyz-linker-Catesbeianin-1电转化至酵母宿主 菌GS115中，通过Zeocin抗生素的筛选获得高效酵母表达菌株；

6、挑取阳性酵母菌甲醇诱导表达，收获表达上清，经SDS-PAGE和western-blot 鉴定，获得人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白。

以下实验表明人溶菌酶-Catesbeianin-1抗菌肽融合蛋白(简称： rhlyz-Catesbeianin-1)对乳房炎的治疗效果：

实验例1

rhlyz-Catesbeianin-1对试验性小鼠乳房炎治疗

1.实验动物与分组方法