[发明专利]一种北冬虫夏草诱变菌株及培育方法

说明书

技术领域

本发明公开一种北冬虫夏草诱变菌株，为一种新的菌株品种，本发明还提供了该菌株的培育方法，属于微生物技术领域。 

背景技术

北冬虫夏草(Cordyceps militaris(L)Link)，又名蛹虫草、北虫草或武式虫草，与冬虫夏草同属子囊菌亚门核菌纲球壳目麦角菌科虫草属，主要分布在我国的山西、陕西、吉林、河北、广东等地。北冬虫夏草是真菌寄生在昆虫蛹或幼虫尸体部分而形成的复合体。中医常用的冬虫夏草是珍贵的药用真菌，但其自然资源稀少，价格昂贵，且人工培养非常困难，至今未能实现规模化生产。 

目前国内外人工培养北冬虫夏草多以其中一种或两种主要成分为评价指标。如果能够获得一株北冬虫夏草菌株，经液态深层发酵培养后，其菌丝体产量、腺苷、虫草多糖、蛋白质、甘露醇等有效成分含量均较野生北冬虫夏草有明显提高，将大大提高该北冬虫夏草的经济价值。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种北冬虫夏草诱变菌株，为一种新的菌株，其有效成分包括腺苷、多糖、蛋白和虫草酸的含量及菌丝体干重均较原出发菌株有明显提高。 

本发明还提供了该菌株的培育方法。 

本发明还公开了北冬虫夏草诱变菌株多糖和腺苷提取的最佳工艺条件。 

本发明的北冬虫夏草诱变菌株为：在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC NO.2909；分类：蛹虫草；分类命名：Cordyceps militaris(L.)Link；保藏日期2009年3月2日。 

本发明所述的北冬虫夏草菌株培育方法，包括以下步骤： 

1)将保藏号为CGMCC 5.699北冬虫夏草菌株，接种于PDA斜面，24-26℃恒温箱中培养4-8天，向斜面试管中注入无菌生理盐水，振荡后用无菌脱脂棉过滤，稀释成浓度为2×10⁷-4×10⁷个/mL的孢子悬液； 

2)在培养皿中加入亚硝基胍10mg及0.5mL丙酮后，用pH＝6.0无菌磷酸缓冲液9mL溶解亚硝基胍，亚硝基胍终浓度为1mg/mL，加入步骤1)中得到的孢子悬液1mL，开始诱变；分别诱变2-20min之后，取菌悬液于无菌蒸馏水中逐级稀释，至浓 度为3×10⁴个/mL，PDA培养基平板培养3-4天后，将菌株于96孔板保存； 

3)利用平板初步筛选生长迅速的菌株； 

4)将筛选获得的菌株在摇瓶中复苏，传代后26℃150rpm恒温摇床中培养3～5天，得菌丝体。 

5)获得的高产诱变北冬虫夏草诱变菌株经过连续传代，培养条件为26℃150rpm恒温摇床中培养84h，测定菌丝体干重、多糖、甘露醇、腺苷以及蛋白质含量，考察诱变菌株的遗传稳定性，从而最终确定目的菌株。 

本发明北冬虫夏草诱变菌株的鉴定： 

将所得到的北冬虫夏草诱变菌株和野生型原出发菌株的总DNA，并以10聚核苷酸随机引物对总DNA进行随机扩增多态DNA(RAPD)比较，确认DNA变异情况，验证菌株在DNA水平上与原出发菌株存在差异，是一株能够稳定遗传的北冬虫夏草诱变菌株。 

用全自动凯氏定氮仪测定北冬虫夏草菌丝体中蛋白总量。利用分光光度法测定甘露醇含量。 

北冬虫夏草诱变菌株的鉴定中，采用苯酚-氯仿法提取北冬虫夏草诱变菌株CGMCCNO.2909和原出发菌株CGMCC 5.699的总DNA。以总DNA为模板，分别以10聚核苷酸随机引物对其进行PCR扩增反应。反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行分离。选取的30个随机引物中，每个引物至少重复两次PCR反应，从扩增结果中筛选出条带清晰，重复性良好，并具有差异性条带的随机引物。最后，切下北冬虫夏草诱变菌株和原出发菌株的差异性条带和空白条带，凝胶回收差异性条带后，利用与RAPD相同的扩增体系和扩增引物进行二次PCR扩增，差异性条带依然存在，说明该北冬虫夏草突变株和原出发菌株相比，在DNA水平上确实发生了改变，是一株不同于原出发菌株的北冬虫夏草诱变菌株。 

本发明所述的高产优质北冬虫夏草突变株的特征为：