[发明专利]一种狂犬病疫苗去除残余DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体说，本发明为疫苗生产过程中一种去除残余DNA的方法。

技术背景

目前狂犬病疫苗的提纯一般采用单一的分子筛凝胶层析或者是阴离子和分子筛相结合的方法，这两种方法都存在着一定的缺陷：

采用单一的分子筛凝胶层析方法，由于狂犬病毒分子量大于其它的杂蛋白分子量，洗脱的过程中，在蛋白浓度较低时，狂犬病毒和杂蛋白可以被分开，但是在实际生产的过程中蛋白的含量往往很高，样品粘稠度大，这就使得采用单一分子筛凝胶层析的方法对病毒蛋白的分离效果不佳，难以达到国家现有的质量标准，同时存在着DNA超标的问题，制约了生产规模。

目前也有采用阴离子和分子筛凝胶层析相结合的方法来去除残余DNA的，用硫酸鱼精蛋白来结合样品中残余的DNA，再用不同盐浓度的缓冲液进行梯度洗脱，收获病毒穿透峰，但是发现硫酸鱼精蛋白在结合了DNA的同时也结合了部分病毒糖蛋白，大大降低了抗原的回收率，同时不同的盐浓度和pH对抗原的稳定性也有一定的影响。

本发明就解决了在纯化过程中抗原回收率低和DNA残留量高的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种提纯方法，采用非限制性核酸内切酶对DNA进行降解，结合膜过滤和柱层析技术对狂犬病疫苗进行提纯。从而得到质量更好，纯度更高的狂犬病疫苗，

本发明的目的是这样实现的：

1)在病毒原液、浓缩液或者纯化液中加入1-2000U/ml的非限制性核酸内切酶，(具体加入量可以根据产品残余DNA的量来调整加入的比例，一般一个单位的非限制性核酸内切酶在标准条件下30分钟内可以降解37ug的DNA)，同时加入终浓度为1-10mmol/L的Mg²⁺化合物做为酶的激活剂，将病毒原液、浓缩液或纯化液置于0-42℃(该酶的最适温度为37℃)中进行DNA的降解来去除残余的DNA。

2)将酶解后的制品用超滤和柱层析的方法进行洗虑、纯化，来去除制品中残余的非限制性核酸内切酶以及降解后的DNA和杂蛋白。

本发明中所应用的非限制性核酸内切酶的特点在于：1)可以降解各种类型的DNA和RNA；2)无蛋白水解酶活性；3)能够在相当宽泛的条件范围内使用；4)具有极高的活性，高达(＞1.0*10⁶Units/mg protein)；5)可以降低细胞裂解液的粘稠度，减少蛋白和核酸的吸附。

本发明的特点在于在浓缩液或纯化液中加入非限制性核酸内切酶，可以有效的降解掉制品中的DNA，而不对其他成分造成任何影响，与现在大多数采用离子交换等方法来去除DNA的相比，本方法不会对抗原造成任何损失和也不会改变抗原的稳定性。

本发明的创新之处在于，采用非限制性核酸内切酶来降解DNA，抗原回收率高，工艺容易放大，DNA去除效果好，同时非限制性核酸内切酶还具有降低样品粘稠度的作用，降低了蛋白的聚合，减轻了柱层析的压力，减少分离纯化的时间，保证疫苗的安全性。

本发明以狂犬病疫苗为实例，同样本发明也适用于其他种类的疫苗及生物制品来去除残余的DNA。

具体实施方式如下

以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。本实施例仅采用常规实验技术，这些均是本技术领域人员所熟知的。或者按照试剂生产商提供的说明书进行。

实施例一

1.用pellicon2系统将病毒收获液进行浓缩和部分杂质的去除。病毒收获液选自采用Celligen Plus生物反应器连续收获的病毒收获液。首先将超滤系统清洗消毒后备用，本实验采用pellicon2超滤系统，膜面积0.5m²，截留分质量300KD，选取30L病毒收获液进行30倍浓缩，浓缩至1L，用β-丙内酯进行病毒灭活。

2.将步骤1所得的浓缩液分成两部分进行实验，编号为①号样品、②号样品，将①号样品采用原始工艺进行单一的超滤纯化，作为实验的对照组，所得浓缩液编号为N-1，纯化液编号为C-1。

3.在②号样品中按50U/ml加入非限制性核酸内切酶，同时向样品中加入终浓度为1mmol/L的MgCl₂，将样品分别置于4℃、20℃、37℃中进行DNA的降解，每隔1小时进行取样检测DNA残留量，考察时间对降解DNA的影响(如表一所示)，再将酶解后的样品用pellicon2系统以PBS洗虑8个体积，取样检测酶的残留量、抗原含量、蛋白含量及效价，样品编号为N-2。