[发明专利]香雪兰UDP-葡萄糖类黄酮-3-0-葡萄糖基转移酶的cDNA

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及从红花香雪兰花瓣中克隆分离编码UDP-葡萄糖类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(UF3GT)的cDNA。 

背景技术

在植物花色形成过程中，UDP-葡萄糖类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(UF3GT)能将花色素催化生成花色苷，糖基化通常发生在该物质的O(OH-和COOH-)、N、S、C原子上，通常是在糖基转移酶的作用下，以核酸活化的糖分子作为供体底物进行的。最常见的受体是羟基化的分子，而UDP-葡萄糖是最常见的供体分子。花色素结合糖苷对花色素的稳定性及在液泡中的溶解性起着至关重要的作用，糖基化作用使花的最大吸收光谱向紫外线端移动而呈现蓝色。 

到目前为止，人们已经克隆得到许多与植物次生代谢产物相关的UF3GT基因，如在玉米(N.V.Fedoroff et al.Proc.Natl.Acad.Sci.119(1988)185-197)，金鱼草(C.Martin etal.Plant J.1(1991)37-49)，龙胆(Y.Tanaka et al.Plant Cell Physiol.37(1996)711-716)，紫苏(Z.Gong et al.Plant Mol.Biol.35(1997)915-927)，葡萄(C.M.Fordet al.J.Biol.Chem.273(1998)9224-9233)，矮牵牛(M.Yamazaki et al.Plant Mol.Biol.48(2002)401-411)等。 

对已有的糖基转移酶氨基酸序列和根据cDNA推测出的糖基转移酶的氨基酸序列的比较分析，编码区具有2个保守的区域：一个是编码44个氨基酸的糖基转移酶所特有的特征性区域(Lim E.K.，Bowles D.J.EMBO J(2004)23：2915-2922)，它被认为是UDP-葡萄糖的结合区域，在这个区域氨基酸序列与其它已知的糖基转移酶基因有43％～78％的相似性；另一个保守的区域位于糖基转移酶基因的上游N端，它们的相似性在30％～45％。但是，这类酶不同成员及在不同植物种类中的蛋白质一级结构序列的相似性很低，所以至今尚未见用糖基转移酶基因保守区合成简并引物获得糖基转移酶基因的报道。 

本发明克隆所得到的FhGT1基因能编码与植物次生代谢过程相关的UF3GT，具体说该基 因是植物花色形成过程中的结构基因之一，能将UDP-葡萄糖上的葡萄糖转移到花色素分子的C3羟基上生产花色苷，保持花色素分子结构稳定，同时是花色素分子运输到液泡必不可少的因素，与花色合成密切相关。 

发明内容

本发明首次从红花香雪兰中克隆得到UDP-葡萄糖类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(UF3GT)的新cDNA，并确定了它的核苷酸序列和由此得出的氨基酸序列。另外，FhGT1基因在大肠杆菌细胞中成功的表达了所述的UF3GT蛋白，并且发现表达的重组蛋白，在体外酶活实验中可以将花色素催化生成花色苷。 

所以，本发明的目的是提供编码UDP-葡萄糖类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(UF3GT)的新cDNA和由此推断的氨基酸序列。 

为了从香雪兰中克隆得到FhGT1基因，本发明首先利用RT-PCR的方法在拟南芥中制备相关的探针，使用ECL发光试剂盒对实验室已建立的红花香雪兰花瓣的cDNA文库进行筛库，分离得到919bp的cDNA片段，测序得到该片段的核苷酸序列。分析该序列显示：此片段与Irishollandica的UDP-葡萄糖类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(UF3GT)同源性最高，达到63％。另外，序列分析显示该片段包含ATG起始密码子。利用RACE法克隆该基因的3’端序列，得到833bp的片段，测序得到该片段的核苷酸序列。分析该序列显示：此片段与Iris hollandica的UDP-葡萄糖类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(UF3GT)同源性最高，达到64％。另外，序列分析显示该片段包含TGA终止密码子。提取红花香雪兰花瓣总RNA作为模板，进行RT-PCR，克隆得到1383bp的全长FhGT1基因，开放阅读框架长1338bp，其编码的蛋白序列长446个氨基酸，蛋白质的分子量推测是48,043Da，等电点为5.71。 

在pET-28(a+)原核表达载体中插入克隆得到的的FhGT1基因，并且转入到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，表达重组UF3GT蛋白。