[发明专利]一种快速检测牛奶样品中布鲁氏菌的PCR方法

说明书

技术领域

本发明公开一种快速检测牛奶样品中布鲁氏菌的PCR方法，用于检测牛奶中布鲁氏菌或者布鲁氏菌DNA，同时还提供了适应上述方法的试剂盒。属于生物检测技术领域。 

背景技术

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种重要的人兽共患传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物疫病，是国际贸易检疫中必检的一种传染病，我国将其列为二类动物疫病。布鲁氏菌包括6个种20个生物型，即羊种布鲁氏菌(B.melitensis)生物型1～3，牛种布鲁氏菌(B.abortus)生物型1～9、猪种布鲁氏菌(B.suis)生物型1～5、绵羊附睾种布鲁氏菌(B.ovis)、沙林鼠种布鲁氏菌(B.neotomae)和犬种布鲁氏菌(B.canis)，其中羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌是引起人、家畜和野生动物流产的主要的病原菌，并且三者之间存在着宿主转移现象。人类通过食用未巴氏消毒的牛奶及奶制品或直接与感染动物或尸体接触而感染。临床上表现为发热(波浪热)、寒战、头痛、全身疼痛、疲劳、脑神经功能障碍症状、关节炎等非特异性症状。至今，布鲁氏菌病仍在我国部分地区流行，并时有疫情爆发的报道，直接危害人类的健康，严重困扰畜牧业的发展和动物及其产品的进出口贸易。 

目前，布鲁氏菌病的诊断手段主要包括病原分离鉴定、虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)和补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、PCR等，用常规方法分离鉴定病原条件要求苛刻，且费力、费时、危险性高、成功率低。RBT和SAT特异性不高、敏感性低；CFT操作繁琐，实验条件和技术水平要求高，实践应用极为不便。PCR方法是这些方法中特异性最强、敏感性最高。在欧美的一些发达国家已经把PCR作为布鲁氏菌病病原诊断的一种工具。国内对于布鲁氏菌病的检疫诊断还相对比较落后，国内很多实验室建设仍然还是空白，对该病的检测仍然采用RBT、SAT和CFT，远不能满足实际需要。因此，开发简便易行、快速、灵敏、特异的分子生物学技术已成为主要的发展趋势。 

发明内容

本发明公开了一种快速检测牛奶样品中布鲁氏菌的PCR方法，适用于牛奶中布鲁氏菌定性检测。 

本发明还进一步提供了适应上述方法的试剂盒及其制备方法，用于检测牛奶中的布鲁氏菌菌含量。 

本发明的快速检测牛奶样品中布鲁氏菌的PCR试剂盒，由DNA提取液、PCR反应液、标准阳性模板、布鲁氏菌BCSP31基因特异性引物对和阴性质控标准品； 

正向引物BF：5′-ATCCAGGAAACCCGACTATGCCA-3′ 

反向引物BR：5′-AACCGCAAAGCTCGCTCCCAAC-3′ 

标准阳性模板含有布鲁氏菌高度保守基因的287个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组载体，该载体在大肠杆菌DH5α中增殖。 

PCR反应液：由正反向引物BF和BR，10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，dNTPs及无菌双蒸水组成。 

布鲁氏菌标准阳性模板所包含的BCSP31基因的核苷酸序列为： 

5′-atccaggaaacccgactatgccattcgccgcctgatgcagggttttgggctgcgtttttaatcgtttcagtcggctctggcggcgctt 

gtcggcaagcgattgtattctttgggaaaatccagaataatggaatgcggtggttgacaatcggcctcaagcttcctatggttttcggcat 

aatctatgcgggaagaggactggtattatgaaattcggaagcaaaatccgtcgcttggctgttgcggcggtggcgggcgcgattgcg 

ttgggagcgagctttgcggtt-3′ 

本发明所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤： 

1)DNA提取液：包括如下组分：10×TE(0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA pH 8.8)，5％NP-40和0.5％Tween-20； 

2)PCR反应液：由正反向引物BF和BR，10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，dNTPs及无菌双蒸水组成； 

3)标准阳性模板：含有布鲁氏菌高度保守基因BCSP31基因287个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组质粒； 

4)布鲁氏菌BCSP31基因特异性引物序列：