[发明专利]多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亚胺共聚物与制法及在基因传递中的应用

权利要求书

1、多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亚胺共聚物，其特征在于，其结构式如下：

R＝-CH₂或者-CH₂CH₂；

PEI为聚乙烯亚胺，结构为线型或者支化，其结构式如下式所示：

式中，聚合度x₁，y₁，z₁均大于或等于0；m，n，x₂，y₂，z₂，a，b，c均大于或等于1。

2、如权利要求1所述的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亚胺共聚物的制备方法，其特征在于步骤和条件如下：

(1)在无水无氧条件下，按照γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体或者β-苄基-L-天冬氨酸-N-羧酸酐单体质量g，与无水氯仿或者无水N’N’-二甲基甲酰胺的体积ml的配比为5～10∶50～1000，将两者投料到干燥的反应器中，充入氮气保护，搅拌溶解；然后将支化聚乙烯亚胺作为多胺引发剂溶解在无水氯仿或者无水N’N’-二甲基甲酰胺中，并加入反应器内，其中多胺引发剂与单体的摩尔配比为1～10∶100～10000，控温0～50℃搅拌反应至少12小时，反应完成后在乙醚或乙醇中沉降，过滤，干燥滤饼，得到多臂聚氨基酸酯；

(2)按照多臂聚氨基酸酯中的苄酯基团与聚乙烯亚胺的摩尔配比为1～10∶2～200，投料到干燥的反应器中；或者，为避免反应过程中聚氨基酸主链断裂，还加入相同于聚乙烯亚胺摩尔量的2-羟基吡啶作为催化剂；按投料的聚乙烯亚胺质量g与无水N’N’-二甲基甲酰胺或者无水二甲基亚砜的体积ml的配比为5～10∶50～1000，把无水N’N’-二甲基甲酰胺或者无水二甲基亚砜加入反应器中，搅拌溶解，控温15～50℃搅拌反应10～80小时；反应完成后，将反应液装入截留分子量为1000～10000的透析带中对去离子水透析至少24小时，将透析后的液体冷冻干燥，得到多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亚胺共聚物。

3、如权利要求1所述的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亚胺共聚物在基因传递中的应用，其特征在于，所述的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亚胺共聚物在体外转染中作为基因传递载体。

4、如权利要求3所述的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亚胺共聚物在体外转染中作为基因传递载体的用法，其特征在于，步骤和条件如下：

(1)细胞的培养

细胞置于含体积分数为10％胎牛血清的培养液中，在37℃，含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中连续培养；

(2)体外转染

转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×10⁴细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80～90％，转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，基因组转染的复合物颗粒以及无血清或者含有体积分数为10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μl，继续培养24小时；

(3)体外转染效率的测定

取出培养板，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，加入细胞裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物，用照度计测定转染效率；

(4)细胞毒性测试

采用噻唑蓝比色法比较评价基因载体材料的细胞毒性；

实验前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×10⁴细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80～90％，将不同浓度的材料与细胞共同培养24小时后，每孔分别加入20μl含质量分数为0.5％噻唑蓝的磷酸盐缓冲液，混合物在37℃继续作用4小时，加入200μl二甲基亚砜溶解噻唑蓝甲臢结晶10分钟，然后用酶标仪测试每孔的吸收，测试波长选用492nm，细胞存活率按下公式计算：

细胞存活率(％)＝(A_sample/A_control)×100

A_sample是转染后的细胞样品孔的吸收，A_control是不与复合物溶液作用的细胞样品孔的吸收，每组实验重复三次。