[发明专利]“网中鱼”方法固定化细胞生产醇类的方法

说明书

技术领域

本发明属于无机化学、物理化学和生物化学、微生物学领域。特别涉及到高稳定性的无机硅化物固定化细胞级别生物体的方法，是“网中鱼(fish-in-net)”固定化酶方法的延伸和拓展。

背景技术

近年来，随着石油的不断消耗，人们正在积极寻找替代能源-燃料乙醇。燃料乙醇作为清洁能源，在日益重视环保的今天，更加受到关注。然而，其普及的关键还是如何降低成本。原始的固定化该细的方法多数为吸附法和包埋法。吸附法的缺点就是容易引起细胞的失活。包埋法大多数是采用有机材料，比如海藻酸盐，卡拉胶等材料，但是海藻酸盐遇磷酸不稳定，固定球机械强度不高等，容易引起球的崩裂。这些有机材料稳定性不好，重复使用次数底，容易导致固定化后的细胞产生逃逸现象，且在有机相中容易产生副反应，从而降低了固定化效率。

发明内容

本发明在于解决上述问题而提出了一种运用“网中鱼”的固定化技术采用硅化物这种稳定的无机材料对细胞实行固定化，用于催化葡萄糖，果糖，蔗糖，生产乙醇，可以多次重复利用多次而仍然保持高催化活性。

本发明与以后技术相比较有以下优点：

1.在温和条件下进行包埋，细胞固定量大，且固定化后细胞稳定不易失活。

2.细胞外部的刚性硅骨架，水热稳定性好，在反应液中无副反应，并可以提高细胞的生长条件范围。

3.固定化的流程操作简单，固定化的材料价格低廉。固定化后可以多次利用，且在多次利用后细胞活力没有明显减少。

附图说明

图1：由热失重图谱可知道：制备出的固定化细胞中，无机外壳∶菌体＝2∶1，固定化菌体量明显。

图2：固定化菌体在电镜下的图片，可以清楚观察到菌体的外貌

图3：为能谱，在菌体表面有明显的Si元素的吸收峰，证明菌体外部由Si基外壳的覆盖。

图4：为氮吸附解析图谱，说明孔道分布相对均匀，能适应菌体各个方位对影响的吸收和代谢，孔道大小为50A，可以满足营养物质的流通。

具体实施方式

仅以运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis固定化为例：

a·菌的培养：(菌群在对数生长期，转移到新鲜培养基中)选用运动发酵单胞菌-，在可供给细菌生长的培养集中培养48-72小时。

b.参照专利CN-1766101A，所制备的前体。硅源选取TEOS(正硅酸乙酯)，在乙醇有机相中与EO-PO-EO类模板剂混合，得到固定化的载体。与浓缩的细胞悬浊液混合，在常温下激烈混合。形成毫米级的白色固体刚性颗粒后，得到固定化的细胞。为保证固定化过程中菌体的生物活性，加入了多羟基物质作为保护剂和助固定化剂。

c.利用含有乙醇的培养液洗脱掉外界的细胞杂质和EO-PO-EO，打开介孔孔道，再将固定化后的细胞放入含有培养液中培养。

所用的洗脱液中乙醇的含量为10％，洗脱液中葡萄糖含量为20％，洗脱时间为4小时。

本发明所用的最终固定化后的细胞培养液中葡萄糖的浓度为15％。

本发明所用的培养基的组成成分是：葡萄糖10％，酵母膏0.5％，硫酸铵0.1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，pH 7.0(自然)。

进一步通过实例来阐述发明的的实现方法：

将固定化的运动发酵单胞菌，以更换培养液/4天为单位。连续发酵14次。得到产率图谱。(乙醇浓度百分比)