[发明专利]嗜热脂肪芽孢杆菌及抗生素残留检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗生素的微生物检测领域，尤其涉及一种嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)及以该菌株为指示菌进行抗生素残留检测的方法。

背景技术

抗生素是一类由微生物和其他的生物在生命活动过程中合成的代谢产物或其衍生物，其在很低的浓度时就能够抑制或干扰病原菌、病毒等的生命活动，如青霉素、四环素、金霉素、链霉素、氯霉素、磺胺类药物等。在医学上，抗生素被广泛的应用于预防和治疗多种微生物感染性疾病以及某些癌症。在奶业的源头中，抗生素使用频率很高，特别是治疗牛乳房炎，常常大剂量反复使用。据统计，约有十多种抗生素以一种或多种联合的形式采用粉剂、涂擦剂、注射剂，以及乳导管注入等方式加以应用，导致抗生素残留相当严重，在奶牛饲料中，也含有抗生素添加剂。许多抗生素如青霉素、四环素、磺胺类药物及某些氨基糖苷类抗生素等均具有抗原性，能使部分易感人群发生过敏反应。轻者表现为荨麻疹、发热、关节肿痛及蜂窝组织炎等，严重时可出现喉头水肿、呼吸困难、过敏性休克，甚至危及生命；有些抗生素具有一定毒性，长期用药对服用者的肝肾功能具有一定损伤，甚至有致癌、致畸、致突变作用；并且可引起长期摄入者体内耐药菌增加，当有重大疾病需治疗时抗菌药物失效。牛奶中抗生素残留是当前原料奶中不容忽视的问题，控制残留的发生不仅需要对奶源进行有效管理，而且要建立先进的抗生素残留检测方法，从而加强奶源质量管理。

检测牛奶及其制品中抗生素残留有多种方法，如微生物检测法；理化检测法； 免疫法等。微生物法是抗生素残留检测最早采用的方法，目前已有多种商品试剂盒，如Delvotest、CharmScien等，以及我国国标TIC法。国标TIC法费用低但存在的问题也很多，如灵敏度较低，操作繁琐，试验菌的制备和使用还没有统一的规定，不同菌株耐药性不同、灵敏度也不同等等。微生物抗生素残留检测方法所采用的菌种有嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜热乳酸链球菌、枯草芽孢杆菌以及藤黄八叠球菌等。国际乳品联合会推荐的微生物检测抗生素残留菌种为嗜热脂肪芽孢杆菌，它对抑制物质的敏感性较高，生长较为快速，所以许多抗生素检测试剂盒采用的是嗜热脂肪芽孢杆菌。国外有关嗜热脂肪芽孢杆菌的试剂盒较多，而国内的商品化试剂盒较少，且大量使用商品化试剂盒检测费用较高，开发一种操作方便、费用低、可靠、可用于大量检测样品中抗生素的检测方法势在必行。而其首要一环是筛选一个对多种抗生素普遍敏感且敏感性稳定、检出限低、生长迅速的指示菌，并抓住其有独特的生物特性指示其萌发、生长代谢。

发明内容

本发明要解决的技术问题是筛选出不易受杂菌污染影响的、对β-内酰胺类抗生素敏感的嗜热脂肪芽孢杆菌株，并据此建立一种简单、快速、灵敏度高、能够普遍推广应用的抗生素残留微生物检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)2009，其保藏编号为CGMCC NO.3287。

一种抗生素残留检测方法，包括以下步骤：

(1)菌株活化

将权利要求1所述的嗜热脂肪芽孢杆菌CGMCC NO.3287菌株接种于斜面培养基上，调节培养基的pH值为6.8～7.2，并在50～65℃的条件下进行优化培养，并进行转种继代培养；

(2)芽孢富集悬浮

加热离心法：将斜面菌种在50～65℃下培养3～5天，用生理盐水洗下菌苔，转移至无菌容器中，充分振荡后，过滤，制成悬浮液，于70～80℃下加热悬浮液10～15min，静置过夜后，以2000r/min离心10～20min，取上清液，4000r/min离心10～20min，弃去上清液，如此反复离心洗涤4～5次后，用生理盐水将离心沉淀悬浮成芽孢悬浮液，调整其OD₆₀₀值至0.25～0.35，于0～4℃下贮存、备用；

(3)紫色培养液配制

以重量百分比计，取葡萄糖、蛋白胨及水为配制成葡萄糖为1％、蛋白胨为1％、pH值为7.0～7.3的培养液，滤膜过滤灭菌后于每100mL营养液中加1.6％的溴甲酚紫溶液0.05～0.07mL；

(4)芽孢杆菌的胶体包埋

取琼脂加热溶解于紫色培养液中制成琼脂重量百分含量为1～2％的紫色培养基，取0.1～0.4mL芽孢悬浮液与50～100mL温度为50～65℃的紫色培养基快速混匀，并迅速分装于检测小管中，于0～4℃下直立静置，密封后0～4℃下保存、备用；琼脂包埋法的优势在于生物相容性好，有利于芽孢的萌发及快速生长；