[发明专利]卷烟主流烟气冷凝物的细胞毒性测定方法

权利要求书

1.一种卷烟主流烟气冷凝物的细胞毒性测定方法，其特征在于：包括以 下步骤：

1)配制实验试剂，包括以下种类：

a、生长培养液：RPMI-1640+10％胎牛血清+2mM L-谷氨酰胺+100 IU青霉素+100μg/ml链霉素；

b、0.01M磷酸缓冲盐溶液(PBS)：0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，8g NaCl， 2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，加双蒸水至1L，pH 7.2～7.4，高压灭菌；

c、样品稀释培养液：RPMI-1640+5％胎牛血清+2mM L-谷氨酰胺+ 100IU青霉素+100μg/ml链霉素；

d、中性红储存液：0.2g中性红，加双蒸水至100ml，过滤除菌；

e、中性红工作液：用RPMI-1640稀释至50μg/ml；

f、中性红提取液：50％乙醇，1％冰醋酸，49％双蒸水，现用现配；

g、阳性对照：十二烷基硫酸钠(SDS)，110μg/ml为50％细胞致死率浓 度；200μg/ml为100％细胞致死率浓度；

h、阴性对照：2％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)；

2)烟气冷凝物的制备通过以下方式：使用DMSO萃取捕集在剑桥滤片上 的烟气粒相组分，制备烟气总粒相物浓度为10mg/ml的烟气冷凝物样品储存 液，于-80℃保存；

3)细胞接种培养，步骤为：经扩增培养的人肺癌上皮细胞系A549细胞进 行消化以后，制备细胞悬液1×10⁵个/ml，96孔板的第一列8个孔中每孔加入 100μl生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100μl细胞悬液，于37℃、5％ CO₂条件下培养24h；

4)烟气冷凝物染毒，过程如下：使用样品稀释培养液将烟气冷凝物样品储 存液调整到不同浓度，卷烟CSC的终浓度设置包括8个非零浓度，分别为：10、 50、75、100、120、140、160、200μg/ml；细胞培养24h后，吸去培养液，96 孔板每列8孔为一组分别设置为空白对照、阴性对照、不同剂量的CSC染毒和 阳性对照处理，每孔加入100μl的含有或不含有阴性对照、卷烟CSC和阳性对 照的稀释培养液，于37℃、5％CO₂条件下培养24h；

5)中性红染色，过程如下：细胞培养24h后，吸去培养液，每孔加入150 μl预热的PBS洗一次，加入100μl中性红染液，于37℃、5％CO₂条件下培养 3h，吸去中性红染液，每孔加入150μl PBS洗一次，加入150μl中性红提取液， 室温下快速振荡10-15min，使用酶标仪检测每孔中性红提取液在540nm波长 处的吸光值；

6)结果与分析通过以下公式进行：

原始吸光值A_(raw)：直接测得的在540nm波长处的吸光值，

经过校正的吸光值A_{(blank-corrected)}：A(blank-corrected)=A(raw)-A‾Blank(raw)]]>

相对吸光值C：C=A(blank-corrected)A‾Negative(blank-corrected)×100%]]>

吸光值的平均值

每个96孔板的阴性对照的原始吸光值的平均值大于0.3，样品的吸光值结 果有效，相对吸光值代表细胞存活率。