[发明专利]丙型肝炎病毒抗体化学发光定性检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种临床血液免疫检测用的一种试剂盒，尤其是涉及一种丙型肝炎病毒抗体化学发光定性检测试剂盒。

背景技术

丙型肝炎(HCV)呈全球性流行，是欧美及日本等国家中末期肝病的主要原因。据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3％。丙型肝炎的传染源主要为急性临床型和无症状的亚临床病人、慢性病人和病毒携带者。HCV主要经血液传播，主要途径有输血和血制品传播、经破损的皮肤和黏膜传播。我国血清流行病学调查资料显示，一般人群抗-HCV阳性率为3.2％，抗-HCV阳性率随年龄增长而逐渐上升，由1岁组的2.0％至50～59岁组的3.9％，男女间无明显差异。

HCV感染的检测可分为特异性检测和非特异性检测，非特异性检测包括ALT，AST，肝功能等辅助性诊断手段；特异性检测可分为感染后抗-HCV特异性检测，病毒基因检测及抗原检测等。其中病毒基因检测系采用RT-PCR方法，可检测出血浆病毒颗粒的浓度，但由于本法容易受污染造成假阳性、成本高、操作烦琐且技术要求严格等因素而难以广泛推广和应用。HCV抗体(其中主要是IgG特异性抗体)的检测是目前国内外对HCV感染检测的最重要的方法。国内外对HCV-IgG抗体检测试剂的研制可分为三个阶段：第一代试剂主要是对NS3区抗体的检测；第二代试剂增加了对HCV-Core区抗体的检测；第三代试剂又增加了对NS5区抗体的检测。

化学发光法作为20世纪90年代才兴起的一种新型检测技术，除具有检测方法简单快速的优点之外，还具有灵敏度高、检测线性范围宽等优点，因此越来越多的受到临床诊断实验室的关注，是近年来该领域研究的热点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种更廉价、更方便快捷的丙型肝炎病毒抗体化学发光定性检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的丙型肝炎病毒抗体化学发光定性检测试剂盒，包括免疫反应滴定微孔板和检测试剂，所述的免疫反应滴定微孔板为不透明聚苯乙烯微孔板；所述的检测试剂包括丙型肝炎病毒抗原、酶标记抗人IgG、发光底物A液和发光底物B液。

所述的丙型肝炎病毒抗原为具有丙型肝炎病毒结构区Core和非结构区NS₃，NS₄，NS₅的融合基因重组抗原。

所述的酶标记抗人IgG为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG，其工作浓度为1.0mg/ml。

所述的发光底物A液由发光剂、增强剂、氨基酸配成；发光底物B液由氨基酸氧化酶和稳定剂配成。

所述发光底物A液由luminol(鲁米诺)0.15mM、羟基香豆素0.59mM、没食子酸0.35mM、Tris-Hcl缓冲液0.2M，pH 9.4组成；发光底物B液由氨基酸氧化酶0.85mM、吐温-200.8％v/v、DTPA(二乙烯三胺五乙酸)0.5mM、维生素C 0.12mM、乙酸-乙酸盐缓冲液0.2M，pH 6.5组成。

不透明聚苯乙烯微孔板预先包被了丙型肝炎病毒基因重组抗原，包被液为碳酸盐缓冲液，包被浓度为2-5μg/ml，包被量100μl/孔，0℃-4℃包被过夜；弃去孔内液体，用PBS-Tween洗液洗板孔1次；用PH 7.2PBS-1％(m/v)、5％(m/v)BSA(牛血清白蛋白)-蔗糖缓冲液，120μl/孔，0℃-4℃封闭过夜。

抗体标记：取辣根过氧化物酶溶于去离子水，加入过碘酸钠溶液活化，加入乙二醇反应，将反应混合物装入透析袋，用醋酸缓冲液透析，加入待标记物混匀，碳酸缓冲液调PH至碱性，加入NaHB₄溶液反应后，装入透析袋，用磷酸盐缓冲液透析，分装后加入蛋白保护剂，-20℃保存。

本发明的优点在于使用本试剂盒采用化学发光免疫分析法对丙型肝炎病毒抗体进行检测，利用酶催化发光底物，则发光底物发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出光子，利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比。

经大量实验证明，使用本发明所述的试剂盒采用化学发光法用于检测丙型肝炎病毒抗体可达到如下指标：

灵敏度——99.5％

精密度——分析内精密度为4.5％(n＝10)，分析间精密度平均为6.8％(n＝10)

特异性——99.3％