[发明专利]一种4-硝基酚-4-单加氧酶基因及制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种4-硝基酚-4-单加氧酶基因，同时还涉及该基因的制备方法，该基因编码的酶能够催化环境污染物4-硝基酚和4-硝基邻苯二酚的降解，能够分解代谢环境中的有毒污染物4-硝基酚和4-硝基邻苯二酚。本发明还涉及一种利用该基因表达有活性的4-硝基酚-4-单加氧酶的方法，以及4-硝基酚-4-单加氧酶在环境污染物微生物分解代谢中的应用。

背景技术

硝基酚是最广泛使用的芳香烃化合物之一，也是研究芳香烃微生物代谢途径和机理的模式化合物。其中4-硝基酚(para-nitrophenol，4-nitrophenol，PNP)是一种重要的化工原料，常作为医药、染料、农药等合成的前体，同时在使用有机磷杀虫剂的环境中由于有机磷的水解也可导致硝基酚的积累。这类化合物常在生产和使用过程中被释放到环境中，它们难以降解，能在环境中长期残留。4-硝基酚能够影响人体的物质代谢，并且在食物链中有富集和放大效应，具有致畸、致突变、引发癌症等危险，严重威胁人类的健康和生存。因此已经被美国环保局列为优先环境污染物(PriorityPollutant List)(http://oaspub.epa.gov/wqsdatabase/)。

进入环境中的硝基酚及其它有机污染物，自然界中起初并不存在利用它们的微生物和酶系，但经过长期的进化，微生物有的自然突变成新的变种，有的通过产生诱导酶以适应新的环境条件，从而能够利用这些污染物作为碳源、氮源或能源进行生长，同时使污染物得以降解或转化。4-硝基酚的代谢研究一直受到人们的关注，已经有多株能够完全代谢硝基酚的细菌纯培养物的报道。相对于其它硝基芳香烃化合物，4-硝基酚的代谢途径最为多样。4-硝基酚的氧化代谢途径是目前报道的最主要的代谢途径，根据中间产物的不同，可以分为对苯二酚途径和苯三酚途径。

4-硝基酚的对苯二酚代谢途径广泛存在于革兰氏阴性菌中，在该途径中，4-硝基酚首先被氧化为对苯二醌(p-benzoquinone)，对苯二醌在还原酶作用下还原为对苯二酚(hydroquinone)，然后进入开环途径。对苯二酚在双加氧酶的作用下开环生成γ-羟基粘康酸半醛(γ-hydroxymuconicsemialdehyde，HMSA)，后者在脱氢酶作用下转化为马来酰乙酸(maleylacetate，MA)。MA在MA还原酶作用下生成β-酮己二酸(β-ketoadipate)并最终进入三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle，TCA)，[Spain JC&Gibson DT(1991)Pathway for biodegradation of p-nitrophenol in aMoraxella sp.Appl.Environ.Microbiol.57：812-819.]。

另一条经典的4-硝基酚代谢途径是苯三酚途径，这种代谢途径在革兰氏阳性菌中广泛存在。在该途径中4-硝基酚在2-和3-位羟化形成苯三酚(1，2，4-benzenetriol，hydroxyquinol)，代谢过程中可能有中间产物4-硝基邻苯二酚(4-nitrocatechol)的产生。苯三酚在双加氧酶的作用下被开环生成马来酰乙酸，然后还原成β-酮己二酸[Jain RK，Dreisbach JH&Spain JC(1994)Biodegradation of p-nitrophenol via 1，2，4-benzenetriol by an Arthrobacter sp.Appl.Environ.Microbiol.60：3030-3032.]。