[发明专利]miR164基因控制水稻根系发育和育性的功能及应用

说明书

技术领域

本发明涉及水稻基因工程技术领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够影响植物根系发育和育性的microRNA(miRNA)及其前体在水稻遗传改良中的应用。所述的miRNA调控植物的根系发育和生长以及花器官的育性。将该miRNA的前体与泛素蛋白的启动子(Ubiquitin promoter)结合后直接转入水稻，转基因水稻植株根系发育显著增强，植株变得不育性；而外施激素可以使转基因植株的育性得到部分恢复。利用这一技术可以培育根系发达的不育系或保持系从而方便地用于杂交水稻的培育。

背景技术

miRNA是真核生物中存在的、由自身基因组编码的、长为20-22nt(nucleotide)的small RNA分子。miRNA主要通过与靶基因的RNA分子互补配对来识别靶基因，然后通过miRNA-RISC(RNA induced silencecomplex)来抑制靶基因的表达(Jones-Rhoades M W，Bartel D P，Bartel B.MicroRNAs and their regulatoryroles in plants.Annual Review of Plant Biology，2006，57：19-53)。miRNA基因的转录本(pre-miRNA)与普通mRNA的结构一致，具有5’-CAP和3’poly(A)等结构。因此pre-miRNA也能通过常规的cDNA文库来克隆到。一般miRNA的转录本不含蛋白编码区，会有几个很小的ORF存在于pre-miRNA分子上，但目前没有发现任何可翻译出蛋白的pre-miRNA分子。形成miRNA所需的pre-miRNA就位于miRNA基因的转录本上，长度在60nt到200nt，少数在200nt以上。Pre-miRNA能形成稳定的foldback的二级结构，被miRNA成熟所需的酶识别。miRNA在植物的生长发育中起着非常重要的调节作用，涉及到植物生长、发育、生物胁迫与非生物胁迫的各个方面。很多miRNA的靶基因是转录因子家族。同一个miRNA往往抑制多个靶基因的功能，同时调节植物生长发育中相互联系的不同过程。例如超表达miR156能使拟南芥的叶片数目增加上百倍，植株干重增加4倍，开花时间延迟(Wu G，Poethig R S.Temporal regulation of shoot development in Arabidopsisthaliana by miR156 and its target SPL3.Development，2006，133：3539-3547)；在玉米中，miR172除了调节开花时间以外还调节花的器官的雌雄分化(Chuck G，Meeley R，Irish E，Sakai H，Hake S.The maizetasselseed4 microRNA controls sex determination and meristem cell fate by targetingTasselseed6/indeterminate spikelet1.Nat Genet，2007，39：1517-1521)；miR159在ABA应答、种子萌发、花的发育和叶片的形状等过程中有重要的调节作用，miR159超表达后，在萌发期植株对脱落酸(ABA)的敏感性下降，开花时间延迟，花药育性降低(Reyes J L，Chua N H.ABA induction of miR159 controlstranscript levels of two MYB factors during Arabidopsis seed germination.Plant J，2007，49：592-606)。

水稻作为最重要的粮食作物，改变植株的形态、育性、开花时间对水稻的产量具有重要意义。miRNA是植物生长发育的一个关键调节因素，miRNA特别是部分高度保守的miRNA往往能够改变植物的许多关键性状。植物根系的发育状况对于植物吸收营养和水分至关重要，发达的根系可以提高植物的营养和水分吸收，提高植物的抗逆性。对植物育性的控制，在利用杂种优势的杂交作物品种的培育过程中具有非常重要的意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的是从水稻中分离克隆一个包含miRNA的DNA片段(在本发明中所述“DNA片段”与“核苷酸序列”同义，下同)，利用这个miRNA分子来控制水稻根的数目和育性。对这个RNA分子进行分析表明它与植物的miRNA164相同，因此被命名为miR164基因。