[发明专利]魔芋软腐病病原菌分子快速检测的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病虫害检疫领域，是利用分子生物学技术对魔芋软腐病病原菌快速的检测。更具体涉及一种魔芋软腐病病原菌分子快速检测的方法，利用荧光定量PCR(SYBR Green I Real time PCR)分子生物学技术对魔芋软腐病病原菌进行快速检测。

背景技术

魔芋又名鬼芋、磨芋等，属被子植物门、单叶植物纲、天南星科魔芋属(Amorphophallus)多年生草本块茎植物，我国主要分布于湖北、云南、四川等长江流域。因魔芋地下球茎中含有葡甘露聚糖，目前广泛用于食品、纺织印染、石油钻探、制药、日用化工等领域，有很好的经济效益。但随着种植面积的扩大，魔芋软腐病危害逐年增强，该病害造成的损失一般在30％-50％，严重者可达80％甚至绝收，这是世界性难题，目前还没有行之有效的措施来抑制该病害的流行。基于当前魔芋科研的技术现状，提供大量优质种芋是降低软腐病发生最有效手段。荧光定量PCR(Real time fluorescent quantitative PCR，Real-time Q-PCR)检测方法是一灵敏度较高的分子生物学诊断方法。荧光PCR检测具有精度高、取样量微小、灵敏度高、稳定性好、检测时间短、检测结果可在10-10¹²拷贝范围，并可以自动量化等特点，国内外曾用于检查口蹄疫、流感、假单胞菌属、炭疽病，脆弱类杆菌等。与常规PCR相比，灵敏度更高，误差更小，且可以达到很好的定量效果。因此，通过此技术对种芋表面细菌洗脱液进行荧光定量PCR反应并参照标准曲线，可定性和定量检测魔芋种芋软腐病原菌的携带状况，为魔芋软腐病早期诊断以及病原菌鉴定提供了新的准确可靠、灵敏快速的检疫技术。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种魔芋种芋携带软腐病病原菌快速检测的方法，方法易行，操作方便，为生产上提供大量健康种芋。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

细菌的培养：取冻存魔芋软腐病病原菌和其他致病菌扩大培养，划线后挑取单菌落接种于营养肉汤培养基(NB培养基)，27-30℃培养过夜后挑取单菌落接种于NB培养基中，27-30℃摇床培养过夜后待用；获得魔芋软腐病病原菌基因序列：用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取魔芋软腐病病原菌基因组，用细菌通用引物(P1：5’-AGA CTT TGA TCC TGG CTCAG-3’，P2：5’-CGG CTA CCT TGT TAC GAC TTC-3’)进行PCR扩增。反应体系为25μl：10mMol的三磷酸碱基脱氧核苷酸2μl，20mMol的氯化镁2μL，pH8.3-8.8(20℃)缓冲液2.5μl，蒸馏水16μl，加10μM的引物P1和P2各0.5μl，2u/μl的Taq酶1μl，模板0.5μl。反应条件是：95℃3min；95℃30s，50℃30s，72℃ 1.5min，循环35次；72℃ 10min。PCR产物以1％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳鉴定，检测到1500bp的条带。将软腐病病原菌基因组PCR扩增产物回收，回收片段与克隆载体pGEM-T(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)连接，然后转化至大肠杆菌DH-5a(武汉大学中国典型培养物保藏中心惠赠)感受态细胞，进行蓝白斑筛选。选取阳性菌落扩大培养后，部分菌液用M13(5′-GCCAGG GTT TTC CCA GTC ACG A-3′，5′-GAG CGG ATA ACA ATT TCA CACAGG-3′)进行普通PCR扩增，凝胶电泳检测，并将检测后确认含有目的片段的阳性克隆送到北京六合华大基因科技股份有限公司进行DNA序列测定，获得软腐病病原菌基因序列；荧光定量PCR特异引物设计：根据基因库中公布的欧文氏杆菌的16S rDNA基因序列以及本实验室分离测序所得的魔芋软腐病病原菌基因序列与其他致病菌的差异，使用Primer5软件(加拿大Premier公司)设计荧光定量PCR特异引物F：5′-ATG CAA CGC GAA GAT CCT TAG GTA C-3′，R：5′-CAT TGA AGC ACG TGT CTA GCC CTA C-3′，该引物扩增的目的片段长度为228bp。引物特异性检测：将提取的魔芋软腐病病原菌基因组DNA和其他致病菌的基因组DNA进行引物特异性检测，反应体系为25μl：10mMol的三磷酸碱基脱氧核苷酸2μl，20mMol的氯化镁2μl，pH8.3-8.8(20℃)缓冲液2.5μl，蒸馏水16μl，加10μM的引物F和R各0.5μl，2u/μl的Taq酶1μl，模板0.5μl。反应条件是：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，循环35次。PCR产物以1％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳鉴定，只有软腐病病原菌基因组检测到250bp的条带，这表明所设计的引物具有特异性。确定荧光定量PCR检测魔芋软腐病病原菌的标准曲线：将软腐病病原菌PCR扩增产物回收，将回收片段与克隆载体pGEM-T(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)连接，然后转化至大肠杆菌DH-5a(武汉大学中国典型培养物保藏中心惠赠)感受态细胞，进行蓝白斑筛选。选取阳性菌落扩大培养后，部分菌液用M13(5′-GCC AGG GTT TTC CCAGTC ACG A-3′，5′-GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG-3′)引物进行普通PCR扩增，凝胶电泳检测，并将检测后确认含有228bp目的片段的阳性克隆送到北京六合华大基因科技股份有限公司进行DNA序列测定，测序结果与基因库中已知序列比对，结果正确后用质粒提取试剂盒(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)提取质粒，用分光光度计测得质粒浓度为112ng/μl，10倍梯度稀释，选112fg/μL、1.12pg/μL、11.2pg/μL、112pg/μL、1.12ng/μL、11.2ng/μL这6个稀释浓度的质粒溶液分别作为模板，进行荧光定量PCR扩增，荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，循环35次。反应体系为：荧光染料(SYBR Green Real-time PCR Master Mix)10μL，蒸馏水8.5μL，加10μM的引物F和R各1μl，模板0.5μl，收集荧光信号，数据用the Rotor Gene 2000 ver4.6软件分析(Corbett research公司)。确定荧光定量PCR检测魔芋软腐病病原菌灵敏度：用分光光度计测量菌液浓度，将菌液浓度为10⁸CFU/ml依次10倍稀释，并取90ml涂平皿，10³CFU/ml有33个菌落，10⁴CFU/ml有328个菌落，而10⁵CFU/ml菌落无法计数，以10⁷CFU/ml-10²CFU/ml的6个稀释梯度进行荧光定量PCR检测。荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，循环35次。反应体系为：荧光染料(SYBRGreenReal time PCR Master Mix)10μL，蒸馏水6μL，加10μM的引物F和R各1μl，模板3μL，收集荧光信号，数据用the Rotor Gene 2000 ver.4.6软件分析(Corbettresearch公司)。荧光定量PCR反应可以检测到10³CFU/ml的浓度，而所用模板是3μL，即1个软腐病病原菌就可以检测到；而荧光定量PCR的产物进行普通PCR检测，只能检测到10⁵CFU/ml的浓度，因此荧光定量PCR的灵敏度比普通PCR高100倍。荧光定量PCR的应用：将有软腐病症状的魔芋在吐温-20中浸泡过夜，这个浸泡液在16000r/min，4℃条件下离心20min，沉淀用10μL无菌水溶解，取1μL作为模板用荧光定量PCR标准曲线对其进行定量分析，将此技术应用于生产实际。