[发明专利]猪免疫力相关分子标记克隆及应用

说明书

技术领域

本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与猪免疫力相关的分子标记的克隆及应用。

背景技术

我国是世界上养猪生产和猪肉消费第一大国，养猪业已经是农村支柱产业之一，家畜的疾病是畜牧生产的大敌，由于疾病造成的经济损失约占畜牧业产值的12％～15％，实际情况还要严重。滥用抗生素导致出口猪肉药物残留的尴尬，先进的疫苗还是抵挡不住周期性猪病的爆发。同时，国内外对猪肉消费提出了新的要求，如“绿色猪”“环保猪”等，这些新问题给猪的雨中育种工作提出了新的要求。近年来，现代育种技术在改良猪生产性状方面做出了很大贡献，但对健康和抵抗疾病的能力的遗传改良还很有限。因此，迫切需要从遗传学的角度来提高猪的抗病性，同现有的措施相配合来解决这些问题。

采用分子遗传学方法从本质上提高猪自身抗病能力的核心是提高猪的免疫力。免疫力是衡量动物健康水平的重要指标，它属于数量性状，受到多基因的调控，分子机制非常复杂，对猪免疫力及其分子机制的解析是畜牧领域的一个研究热点，而旨在提高猪免疫力的育种工作也被称作抗病育种。在抗病育种工作过程中免疫相关的重要基因的克隆和相关分子标记的开发与应用又是研究的重中之重。

本发明选取的Cav1基因便是这样一个在细菌和病毒攻击宿主过程中发挥至关重要作用的基因之一。Cav1属于Caveolin家族，编码Caveolin1蛋白(中译名窖蛋白)。Caveolin1蛋白是构成脂筏和细胞窖的主要成分，它分布于许多不同类型的细胞中。研究发现该基因参与多种细胞生命活动，如细胞内吞、胆固醇运输、胞膜形成、信号传导、肿瘤生成。而在这些生命过程中，Caveolin1都发挥着极为重要的作用，因此对其功能的研究已经成为现在生命科学的一个热点。

随着研究的深入，人们发现Caveolin1蛋白还参与多种细菌和病毒性病原体入侵宿主细胞的过程，如HIV-1等病毒和Mycobacteria、E.coli等细菌。国外研究表明HIV21的跨膜糖蛋白gp41有一个保守的Caveolin结合基序(CBD)。值得注意的是，在HIV感染的细胞中，存在一个稳定的gp41与Caveolin1蛋白的复合物，因此抗CBD的抗体可能能够抑制gp41与窖蛋白的相互作用，利用这一原理可以开发治疗艾滋病的疫苗。

不仅如此，Caveolin-1亦在病原体增殖过程中发挥重要作用，Marjomaki等分析了Echovirus1(EV1)在结合到受体后早期感染及其进入宿主细胞的途径。EV1结合到宿主细胞表面后，病毒衣壳构象发生变化。该研究发现EV1在细胞核周围的囊泡结构中存在，电镜显示EV1病毒颗粒存在于胞膜窖中。不表达Caveolin1的细胞不能感染EV1，这说明Caveolin1蛋白在EV1病毒复制增殖中是非常重要的。

但是目前国内外对Cav1基因研究主要集中在人类医学领域，对猪Cav1基因研究较少。而且迄今为止尚没有利用猪Cav1基因来寻找与猪免疫力相关的分子标记的报道。因此，申请人克隆了与猪免疫力相关Cav1基因的cDNA，利用该cDNA序列进行了多态性和关联分析等研究，以期得到新的作为猪免疫力相关的分子标记。

发明内容

本发明的目的在于克隆与猪免疫力相关的分子标记，利用该分子标记作为猪标记辅助育种的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人克隆得到一种与猪免疫力相关的分子标记，它是序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。在序列表SEQ ID NO：1的第387bp处有1个由G387-C387的碱基突变，导致HaeIII-RFLP多态性；在序列表SEQ ID NO：1的第474bp处有1个由A474-G474的碱基突变，导致MbiI-RFLP多态性。在序列表SEQID NO：1的第512bp处有1个由G512-A512的碱基突变，导致AciI-RFLP多态性。

其中，克隆猪Cav1基因的引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：5′AATCTCCTCAGAGCCTTCATCC 3′，反向引物：5′CGCTGTACTGGCAAATTGAAAC 3′。

检测SEQ ID NO：1所述的分子标记(即检测碱基突变)所用的引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：5’-ACTGGTTTTACCGTTTGC-3’，反向引物：5′-GAAACTCGAAATTGGCAC-3′。

申请人建立一种制备上述分子标记和检测上述分子标记的方法，该方法的步骤如下：