[发明专利]心力衰竭的生物标志物的联合并行检测方法及诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外诊断检测方法及诊断试剂盒，特别是涉及多种心力衰竭的生 物标志物的液相芯片联合并行检测方法及其诊断试剂盒。

背景技术

心血管疾病是中国城市人口和西方发达国家的主要疾病和主要死亡原因之一，其 中心力衰竭(heart failure，HF)更严重危害着人类的生命健康。心力衰竭的生物 标志物(以下可简称为“心衰标志物”)不仅能够准确诊断心力衰竭，评价其严重程 度，还能指导临床治疗和疗效的监测，判断心力衰竭的预后。因此各种不同类型的心 衰标志物的联合并行检测已成为必然，而多指标并行检测的高通量迅速性、准确性和 稳定性就更加至关重要。

钠尿肽已成为目前国际公认的心衰标志物，包括A型钠尿肽(ANP)、B型钠尿肽 (BNP)、N末端前钠尿肽(NT-proBNP)。近年来研究发现的与心力衰竭相关的生物标 志物还包括内皮素(ET-1)，肾上腺髓质素(ADM)等。

目前，对于心衰标志物的测定已有多种检测方法，包括免疫荧光分析、酶联免疫 分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、磁分离酶联免疫分析(EIMA)等。但是这些技 术一次只能针对一种标志物进行检测，且操作繁琐、灵敏度较差，不能真正满足临床 诊断检测的需要。而固相生物芯片技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁 琐的缺点。

液相芯片技术(xMAP)是一种可广泛应用于蛋白质、基因、受体/配体等多种生物 反应的生物芯片技术平台，主要包括微球、探针分子、被检测物和报告分子四种成分。 在微球的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种荧光的比例不 同，把球形基质分为100种，可以标记上100种不同的探针分子，能同时对一个样品中 多达100种不同的目标分子进行检测。反应过程中，探针和报告分子都分别与目标分子 特异性结合。反应结束后，使单个的微球通过检测通道，使用红、绿双色激光同时对微 球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测，可确定所结合的检测物的 种类和数量。

本发明基于液相芯片技术的高灵敏度、高通量、检测迅速等突出优点，对心力衰竭 的多种生物标志物进行并行检测，能够在临床检测上得到更好的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于心力衰竭生物标志物的液相芯片检 测方法及其诊断试剂盒，该检测方法及试剂盒包括针对ANP、BNP、NTproBNP、ET-1、 ADM五种心衰标志物的联合并行检测，具有高灵敏度、高特异性、稳定性好、检测迅 速等优点。

为解决上述技术问题，本发明的一种心力衰竭生物标志物的液相芯片联合并行检 测方法，包括以下步骤：

(1)将不同编号的、表面羧基修饰的微球(Beads，编号分别为11、15、21、33、 37)活化后，使相应的捕获抗体(抗心衰标志物的抗体)与相应的微球偶联，形成“捕 获抗体-微球”二联复合体，所述的每一种捕获抗体分别抗一种心衰标志物，从而使 待测样品中的心衰标志物与捕获抗体形成“心力衰竭生物标志物-捕获抗体-微球” 三联复合体；

(2)将不同的检测抗体进行生物素(Biotin)标记，其中所述的每一种检测抗体 分别抗一种心衰标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该标志物的不同 抗原表位；

(3)将步骤(1)形成的三联复合体与步骤(2)中的含有生物素标记的检测抗体 混合，从而形成“生物素标记的检测抗体-心力衰竭生物标志物-捕获抗体-微球” 四联复合体；

(4)将步骤(3)中的四联复合体与链霉亲和素-藻红蛋白(Streptavidin-PE) 结合后，检测出不同微球的荧光信号，从而确定待检测样品中各种心衰标志物的存在 及含量。

以上所述检测方法，还包括步骤：将步骤(4)中测定的可检测荧光信号与标准 曲线进行比较，从而确定待检测样品中各种心衰标志物的含量。

所述的微球是平均直径为5.6μm，且结合了不同荧光染料的聚苯烯微球，即色彩 编码微球(color-coded beads)。