[发明专利]一种构建GFOR过表达质粒提高山梨醇产量的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及山梨醇生产技术领域，具体地说，是一种通过构建一个葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)过表达质粒，并在运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis ZM4)中将葡萄糖-果糖氧化还原酶过量表达，从而增强山梨醇生物催化生产效率及得率的方法。

【背景技术】

山梨醇是一种存在于许多水果中的多羟基化合物。山梨醇的应用范围很广，它是一种最具开发潜力的关键中间体。目前，山梨醇主要是合成维生素C的原料，大约有20％用于生产维生素C；同时，山梨醇作为甜味剂、保湿剂、软化剂也被广泛用于食品工业、化妆品、药品的生产。目前较为普遍的生产方法是采用葡萄糖催化加氢法生产山梨醇。

生物法生产山梨醇就目前而言，在能生产山梨醇的微生物中只有运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)具有实现工业化的潜力。运动发酵单胞菌能够组成型的表达一种葡萄糖-果糖氧化还原酶(Glucose-Fructose oxidoreductase，GFOR)。该酶通过紧密结合的辅酶(NADP)催化葡萄糖氧化为δ-葡萄糖内酯并产生1mol的还原力(NADPH)；同时该酶将NADPH中的电子提供给果糖，完成果糖向山梨醇的转换(见图1)。而δ-葡萄糖内酯会在该菌株生成的δ-葡萄糖内酯酶或者自发水解的作用下，迅速转化生成葡萄糖酸。由于葡萄糖-果糖氧化还原酶催化反应的高度选择性以及该反应条件的温和性，因此该法不涉及到高压容器的使用，生成的两个产物山梨醇和葡萄糖酸都是重要的化工原料并可分别进行回收利用。根据生物法生产山梨醇的以上优点不难看出，利用生物法生产山梨醇的化工过程符合当今经济和社会发展对低能耗，低污染工业技术的需求，有可能发展成为现有生产山梨醇的替代技术。

利用生物法生产山梨醇与其他生物催化法生产化学品有着共同的一个特点就是：方便的获得大量、性质稳定和廉价的生物催化剂(酶或细胞)是决定生物催化过程能否真正用于实际工业中的一个决定因素。根据以往国内外相关的文献报道可知，来源于运动发酵单胞菌的葡萄糖-果糖氧化还原酶具有良好的稳定性以及高度的催化选择性。整个酶催化反应机理单一，除山梨醇和葡萄糖酸外没有其他副产物。经过大量和长期的研究，国内外学者提供了各种经济可行的细胞催化反应工艺；然而，作为催化剂的GFOR的来源，始终是制约该过程在实际中得以应用的一个关键瓶颈。国外曾有许多学者曾通过将运动发酵单胞菌中编码GFOR的基因(gfo)进行克隆，并将其置于大肠杆菌表达体系中进行过量表达，以期获得大量和廉价的酶制剂(Arch.Microbiol.1996，166，32-41；)。然而，由于编码GFOR的基因在运动发酵单胞菌中表达后存在一个表达后转运以及加工的过程(其具体机理仍然未见相关报道)，因此编码该酶的基因至今仍然无法在大肠杆菌及其他常见表达体系中大量表达出具有活性的产物(J.Bacteriol.1992，174，1439-1447；Structure 1996，4，1413-1428；Eur.J.Biochem.1997，244，107-112)；GFOR的来源仍然仅限于从运动发酵单胞菌中提取获得。尽管曾经有文献报道，通过使用高糖浓度培养基以及使用玉米浆代替发酵培养基中的酵母提取物的方法可以在一定程度上提高运动发酵单胞菌发酵生产GFOR的产量或者降低生物催化剂制备过程的成本(BrazilianJ.Microbiol.2003，34，329-333)，然而整个过程中GFOR得率以及比酶活低仍未能得到有效的解决。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种通过构建一个葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)过表达质粒，并在运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis ZM4)中将GFOR过量表达，及其在制备山梨醇中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明使用的表达载体是本实验室构建的革兰氏阴性菌细菌广泛宿主接合转移质粒pLT20a；所构建的表达载体pLT20a-gfo的表达单元具有如表1所示的核苷酸序列(SEQ ID No：1)，其中引物序列根据此序列进行设计，并通过在引物的两端添加XbaI和EcoRI限制性内切酶识别序列用于基因的克隆以及pLT20a-gfo载体的构建；

本发明所设计的构建引物，具有如表2所示的核苷酸序列(SEQ ID No：2)；

本发明所构建的多拷贝表达载体pLT20a-gfo，其在Z.mobilis ZM4菌体中的拷贝数为两个或者两个以上；