[发明专利]一种HER-2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种HER-2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用。

【背景技术】

根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数160万，死亡人数近160万，患者600万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。乳腺癌是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤，近年来发病率稳定上升且趋年轻化，发病率在女性肿瘤中居第三位。据世界范围统计，全球每年约有120多万人患乳腺癌，工业发达国家乳腺癌进一步增加，根据美国癌症协会(ACS)的报告，美国每年超过20万人接受乳癌治疗，其中约四万人被夺去生命。从2006中国乳腺癌内分泌治疗高峰论坛上了解到，中国是乳腺癌发病率增长最快的国家之一，我国每年有约20万名妇女患乳腺癌，中国乳腺癌发病率每年约增长3％；在京、津、沪等大中城市，乳腺癌已跃居女性恶性肿瘤之首。研究显示，乳腺癌发病与家族遗传有密切关系，特别是犹太人妇女有一种特殊的BRCA1基因变异与家族性乳癌密切相关，家族遗传导致的乳癌大约占所有病例的5％-10，有乳癌家族史同时有BRCA1基因变异的妇女，她们一生中有85％机率患乳癌，而且有50％的机率患妊巢癌。同时发现，BRCA1基因无变异的大部分妇女患乳癌，研究发现与HER-2基因的表达有关，HER-2是人类表皮生长因子受体(her-2)，是一种受体型的酪氨酸激酶。在20％～30％的乳腺癌中具有Her-2受体的过度表达，三分之一乳癌与HER-2有关。Her-2过度表达细胞表面的Her2蛋白水平较周围正常乳腺上皮细胞高出数十倍乃至数百倍。Her2是乳腺癌的预后因子，它的阳性状态与乳腺癌预后差相关。因为上述原因，提示Her-2也可以作为治疗靶位。研究中发现通过抗Her-2的单克隆抗体可以显著的抑制有这种蛋白高度表达的人类乳腺癌细胞的生长，作用于乳腺癌细胞的Her-2/Neu表面蛋白，干扰其生物学进程，最终导致其死亡，即乳腺癌的生物靶向治疗。我们在研究中发现乳癌患者有35％HER-2基因表达增高。

乳腺癌从癌前变到形成癌症，需要几年时间，如何做到早期检测、诊断、及诊治后的复发、转移早期检出是降低发病率和死亡率的关键。常规的影像医学检查只能诊断是否有占位的癌肿块，也就是说发现已属于癌症晚期，往往病人的生存期不长。如何在更早期发现(癌变前期)它有非常重要的临床意义，也就是说如何从单细胞水平和基因水平做到早期诊断和转移复发的早期检测是我们要实现治愈乳癌的关键。现在临床上有一个错误概念，依照传统的影像医学和结合其它生化检测指标，判定占位性的癌症在二公分以下是属于早期癌症，这一概念值得认真讨论。医学影像学的2CM以下的肿块属于早期癌症这一界限科学性是不够严谨的，从细胞学的角度，1CM肿块约有1亿个肿瘤细胞，2CM的肿块其三维空间的细胞叠加数目，远不止2亿个肿瘤细胞。由于目前临床上的诊断手段比较缺乏，通过X线、B超、CT、核磁共振等的手段能分辨在1-2CM以下的肿瘤已经不错。而事实上是，从单克隆癌细胞到2CM以下的肿块可能是相当长的病理演变过程，可能是一年或两年及三年以上，从癌变前期到癌细胞形成及生成2CM肿块要经过相当长的病理演变过程，在这个病理演变过程中，难以证实早先形成癌细胞克隆肿块是唯一的癌块，可能在最早形成克隆肿块的同时，癌细胞通过不同的途径迁移到其它部位克隆生长。这在临床上已得到证实，一旦切除肿块后，其他地方会出现复发或其它多发的肿块先后形成或转移。因此，在临床上以2CM以下大小的肿块来界分早期与否，不够严谨，事实上这时的癌变已属于晚期，这导致癌症死亡率不降的真正理由。美国所有的主要健康组织都认为对癌症的早期检测是挽救生命，降低晚期治疗费用的关键。

随着分子生物学和肿瘤分子病理生理学，功能基因组学，疾病基因组学，癌症基因组学的研究深入，以及分子生物技术的日益完善，至今有可能在癌变前期或癌细胞形成(单克隆时)或突破血管壁早期转移时，就能做到早期预测诊断，这一技术的实施可能是肿瘤诊治方法的一次革命。做到更科学的早期诊断、早期预防、早期治疗，希望彻底治愈癌症。

原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。