[发明专利]乙肝病毒拉米夫定耐药变异株的检测探针及其应用方法

说明书

技术领域

本发明属医学领域，涉及乙肝病毒拉米夫定耐药变异株的检测探针及慢性乙肝患者使用拉米夫定抗病毒治疗后耐药情况的临床监测。

背景技术

以拉米夫定(lamivudine，LAM)为代表的核苷类似物类抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)药物的临床应用是慢性乙型肝炎治疗史上的里程碑。迄今为止，已经有100多万慢性乙型肝炎患者接受了拉米夫定治疗，使慢性乙型肝炎的治疗取得了巨大的进步。抗HBV药物的广泛应用在为慢性乙型肝炎患者(chronic hepatitis B，CHB)带来福音的同时，也带来了严重的耐药问题。例如拉米夫定治疗1～4年的耐药率可分别高达14％、38％、49％和66％。引起HBV对拉米夫定耐药主要原因是在HBV的聚合酶基因的逆转录B区的180位氨基酸由亮氨酸(L)替换成了蛋氨酸(M)和C区的204位氨基酸由蛋氨酸M替换成了缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)。即造成YIDD或YVDD变异，LAM与其的结合力就会下降，导致HBV对LAM产生耐药性。除了YMDD变异之外，在LAM选择压力下，还会在YMDD基序之外出现补偿性变异。目前，国内尚无同时用于多个变异位点检测的试剂盒。为此，我们研发了液相芯片(Multi-Analyte Suspension Array，多功能悬浮点阵仪)技术，可快速、简便和高通量地检测LAM耐药变异株。

对于LAM耐药相关性变异的检测，除了DNA测序分析之外，国外报道可使用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、INNO-LiPA探针检测法、特异性PCR及固相芯片等方法。测序分析方法需要昂贵的测序仪，检测过程耗时较长，且只有当病毒群中HBV变异株至少占30％以上时(通常需50％以上)，才能检测到变异株，用于变异株的早期检测有较大的局限性；基于PCR-RFLP的方法可能一次只能检测一种类型的变异；而INNO-LiPA探针检测法虽然灵敏度较高，但检测成本较高，且操作复杂耗时，检测通量较低，同时价格昂贵，推广应用受到限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种乙肝病毒拉米夫定耐药变异株的检测探针及相应的乙肝病毒拉米夫定相关变异应用检测方法。

本发明提供了一种乙肝病毒拉米夫定耐药变异株的检测探针，该检测探针可以是SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18或者SEQ ID NO 19中的一种或者几种。

较好的，该探针由SEQ ID NO 12、SEQID NO 13、SEQ ID NO 14中的一种或者几种和SEQID NO 15、SEQID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18或者SEQ ID NO 19中的一种或者几种组成。将序列SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14中的一种寡聚核苷酸分子与序列如SEQID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18或者SEQ ID NO 19中的一种寡聚核苷酸分子组合，进行检测可同时获得两个耐药性位点的测试结果，能够更准确地获得样本的拉米夫定耐药性特征。

本发明的探针也可由SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ IDNO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 19全部八种寡核苷酸分子组成。同时使用八种寡核苷酸分子作为检测探针，不仅能准确地获得样本的拉米夫定耐药性特征，而且可以确定乙肝病毒拉米夫定耐药变异株的类型。

上述这些探针可以根据其核苷酸编码序列，采用化学合成方法，也可以采用从乙肝病毒拉米夫定耐药变异株的基因组DNA通过多次PCR获得。

本发明还提供了将该检测探针用于确定乙肝病毒拉米夫定耐药变异株方面的应用。