[发明专利]锁核酸和小沟结合物共修饰核酸片段

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及寡核苷酸的标记方法。 

背景技术

为了保证在PCR扩增过程中，探针或引物与模板的结合效率，探针和引物都有一定的长度的限制。一般所设计的引物长度在18~25个碱基，而像TaqMman探针的长度一般为20~40个碱基。但在实际过程中，在一些突变位点，SNP和高变异病毒的检测中，一般的探针和引物往往检测效果不理想，灵敏度和特异性很差。 

MGB全名minor groove binder即小沟结合物，是源于某些抗菌素分子的化学基团，其能嵌入DNA双螺旋结构中的小沟形成非共价结合，一般可以将寡核苷酸的退火温度提高10度以上，可以缩短引物或探针的长度，提高特异性和给设计带来方便。锁核酸(Lockednucleic acid，LNA)，是新型的核酸类似物，它包含了2’-氧4’碳亚甲基连接，这个连接限制了呋喃核糖环的灵活性，因而将其结构锁定成一个刚性的双环模式，因此而提高杂交效率和优越的稳定性。LNA单分子的化学结构决定了寡核苷酸序列与目标序列杂交后的稳定性，与未标记相比，其双链在相同的盐溶液中，每增加一个单体LNA分子将导致其退火温度提升8℃。可以缩短引物或探针的长度，提高特异性和给设计带来方便。但是这两种方法由于其提高退火温度有限，因此有时也不能完全满足设计的要求。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种更好的标记寡核苷酸的方法，用于DNA突变识别检测和SNP的识别。 

本发明一方面提供了一种标记寡核苷酸的方法，为在同一条寡核苷酸链上即标记LNA又标记MGB。 

所述MGB标记在所述寡核苷酸链的3`端；所述LNA标记在所述寡核苷酸链的个别核苷酸上。 

进一步的，所述个别核苷酸为发生突变的碱基。 

在确定MGB及LNA在寡核苷酸链上的位置后，可通过寡核苷酸自动合成仪按亚磷酰胺合成方法自动合成并标记设计好的序列。 

本发明适合标记的寡核苷酸链的长度为10-18个碱基。 

本发明的标记寡核苷酸的方法可用于DNA突变和SNP的识别检测。 

本发明第二方面公开了一种LNA(Locked Nucleic Acid)和MGB(Minor GrooveBinder)共修饰的核酸片段，为既标记有LNA又标记有MGB的寡核苷酸链。 

进一步的，所述MGB标记在所述寡核苷酸链的3`端；所述LNA标记在所述寡核苷酸链的个别碱基上。 

进一步的，所述经标记的核酸片段为Taqman探针，所述寡核苷酸链的5’端还标记有报告荧光基团，3’端标记有不发光的淬灭基团。 

较佳的，所述报告荧光基团为FAM或VIC，不发光的淬灭基团为NFQ。 

本发明第三方面公开了上述寡核苷酸链作为引物、Taqman探针的应用。 

进一步的，本发明的寡核苷酸链可作为引物或Taqman探针用于DNA突变识别检测。 

研究发现，将MGB与LNA同时标记修饰寡核苷酸，相比单个标记可进一步提高其稳定性，从而使其退火温度提高。这样不仅让实验者在设计中拥有更大的选择空间，还可以提高寡核苷酸序列的特异性。 

本发明的新型寡核苷酸通过运用MGB(minor groove binder)和LNA(Locked nucleicacid，LNA)的组合修饰：1)使Tm值提高了12-25℃，比只运用一种修饰技术的Tm值提高8-15℃提高了10℃左右。这可以保证寡核苷酸在满足Tm值的条件下，比单修饰或不修饰的序列更短，2)寡核苷酸序列中对A，G，C，T的组成要求降低。这些改变使得寡核苷酸：对核酸序列突变和SNP的识别能力增强。 

本专利运用非常广泛，可以有效的运用到引物，Taqman探针等。 

附图说明

图1：反应条件1反应体系1-样品1的PCR结果 

图2：反应条件1反应体系1-样品2的PCR结果 

图3：反应条件1反应体系1-样品3的PCR结果 

图4：反应条件1反应体系1-样品4的PCR结果 

图5：反应条件1反应体系2-样品1的PCR结果 

图6：反应条件1反应体系2-样品2的PCR结果 

图7：反应条件1反应体系2-样品3的PCR结果 

图8：反应条件1反应体系2-样品4的PCR结果 

图9：反应条件1反应体系3-样品1的PCR结果