[发明专利]一种具有β-内酰胺酶抑制活性的多肽及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及一种具有β-内酰胺酶抑制活性的多肽及其制备方法和应用，包括该多肽的编码基因及其重组表达载体和转化子。

背景技术

β-内酰胺类抗生素(青霉素和头孢菌素)在临床上用于治疗多种细菌感染疾病，但随着抗生素的广泛应用以及某种程度上的滥用，耐药菌在不断地产生，它们对许多β-内酰胺抗生素耐药，从而使这类药物对耐药菌感染的疾病无效。微生物来源的β-内酰胺酶的抑制剂棒酸(Clavulanic acid)及其β-内酰胺砜类化合物舒巴坦(Sulbactam)和他佐巴坦(Tazobactam)，均在七十年代至八十年代被发现并证实是有效的β-内酰胺酶的抑制剂，且作为“自杀者”与β-内酰胺抗生素合并用药，可达到抑制β-内酰胺酶活力、增强β-内酰胺抗生素疗效的目的。然而，这些小分子化合物对一些细菌产生的由染色体介导的I型β-内酰胺酶的抑制作用都很小。

近来人们从带棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)中分离到β-内酰胺酶抑制蛋白(β-lactamase inhibitory protein，BLIP)，可以特异性的抑制β-内酰胺酶的活性，随后又有BLIP-I、BLIP-II被发现。但是β-内酰胺酶抑制蛋白BLIP，分子量比较大，有165个氨基酸组成，并不适合开发成为临床使用的药物。BLIP与β-内酰胺酶的结合具有几个关键结合位点。本申请人的专利ZL200410084577.1中根据关键结合位点设计并合成了随机寡核苷酸库，从中筛选到24肽SIPIS04-01，体外作用表明具有抑制β-内酰胺酶的活性，适合用于作为基因工程表达药物，但是该24肽SIPIS04-01的抑制β-内酰胺酶的活性并不高。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的具有β-内酰胺酶抑制活性的多肽存在的活性低的不足，提供一种新的具有β-内酰胺酶抑制活性的多肽及其制备方法和应用，同时提供该多肽的编码序列及其重组表达载体和转化子。

本发明人经过仔细研究发现，随着BLIP与β-内酰胺酶结合关系的研究的深入，包括结构生物学以及热力学，影响二者结合的“热点”(hotspot)关键氨基酸不断被发现。据此，本发明人通过反复的试验，将之前得到的24肽SIPIS04-01的编码基因，根据大肠杆菌密码子偏爱性进行改造，然后通过关键位点的氨基酸替换，并延长其N端，终于制备了新的具有更强β-内酰胺酶抑制活性的小肽，从而完成了本发明。

因此，本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种具有β-内酰胺酶抑制活性的多肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示，其中，第25位的“Xaa”表示非极性氨基酸残基。

本发明中，所述的非极性氨基酸残基包括Ile，Met，Gly，Ala，Val，Pro，Leu，Trp，或Phe，较佳的是丙氨酸(Gly)残基或甘氨酸(Ala)残基。当所述的非极性氨基酸残基是丙氨酸残基或甘氨酸残基时，本发明所述的多肽的氨基酸序列较佳的如序列表中SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：一种DNA序列，其编码具有β-内酰胺酶抑制活性的多肽，是下列之一：

1)其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.5所示，其中，第73～75位的“nbn”表示编码非极性氨基酸残基的密码子序列；

2)其编码如序列表中SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的多肽，其中，第25位的“Xaa”表示非极性氨基酸残基。

本发明中，所述的非极性氨基酸残基包括Ile，Met，Gly，Ala，Val，Pro，Leu，Trp，或Phe，较佳的是丙氨酸(Gly)残基或甘氨酸(Ala)残基。当所述的非极性氨基酸残基是丙氨酸残基或甘氨酸残基时，本发明的编码具有β-内酰胺酶抑制活性的多肽的DNA序列，较佳的是下列之一：1)其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示；2)其编码如序列表中SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多肽。

本发明还提供一种重组载体，其含有任一项如上所述的DNA分子。较佳的，所述的重组载体的载体骨架是质粒pET32a。

本发明还提供一种转化体，其含有如上所述的重组载体。较佳的，所述的转化体的宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)，如E.coli BL21(DE3)。