[发明专利]适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基

说明书

【技术领域】

本发明涉及现代生物技术之培养基研发技术领域，具体地说，是一种适于动物细胞大规模培养及抗体、融合蛋白等重组蛋白药物产品生产的无动物来源低蛋白培养基。

【技术背景】

动物细胞培养技术是当今生物工程领域中的前沿课题之一，无论是基础研究还是生产实践方面都得到生物技术界的重视。2000年以来，FDA批准的所有创新生物技术药物中，用酵母表达的只有2种，用大肠杆菌表达的只有6种，而用哺乳动物细胞表达或生产的药物达到55种，占70％以上。2003年6月～2004年6月全球销售额最高的10个生物技术药物中，哺乳动物细胞表达的产品占8个，并且年销售额超过20亿美元的前6位的生物技术药物全部是哺乳动物细胞表达的产品。2005年全球生物技术药物销售额超过500亿美元，哺乳动物细胞表达产品占70％。至2007年末，仅单克隆抗体药物的销售额就达到260亿美元，预计至2013年其销售额将达到490亿美元。应用无血清培养技术进行动物细胞的规模化培养及重组蛋白表达生产已成为一种趋势。

随着哺乳动物细胞培养规模的扩大和生物药物需求的增长，基于细胞及产品特性的无血清培养基的研制已成为细胞工程领域的重要课题。在疫苗生产、单克隆抗体和各种生物活性蛋白等生物制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分，使工程细胞在最有利于其生长和目的产物表达的培养环境中维持较高的活细胞密度和较长的培养时间，是降低生产成本的有效方法。

与传统的有血清培养基相比，无血清培养基具有诸多优势：第一，无批次差异、无不明血清组分对细胞的影响；第二，避免了血清中外源性污染及对细胞的毒害作用；第三，使产品易于纯化，提高回收率；第四，成分明确，有利于研究细胞的生理状态，可根据不同细胞株设计和优化能支持其高密度培养和产物高水平表达的培养基。此外，无血清培养技术也是进行细胞生长、增殖、分化及基因表达调控等基础研究的关键技术之一。

无血清培养基的开发与优化，主要有以下两个发展方向：一是不添加任何动物来源的成分；二是降低培养基的蛋白质含量。据此，无血清培养基可以分为以下三种：

(一)传统的无血清培养基，即用各类可替代血清功能的组分配制而成，如添加牛血清白蛋白(BSA)、转铁蛋白、胰岛素、从血清中提取的混合脂类及水解蛋白等组分，其特点是蛋白含量高，含有大量动物来源蛋白。

(二)无动物来源成分的培养基，即祛除培养基中的动物来源成分。由于动物来源成分中可能含有潜在的朊蛋白和病毒污染的危险，因此，在培养基中必须慎用动物来源成分，这样才可确保生产的重组蛋白安全可靠。

(三)低蛋白或无蛋白培养基，即减少或祛除培养基中蛋白质成分。降低培养基中的蛋白质含量，可减少产物的分离纯化步骤，提高目标蛋白的回收率和品质，保证批次间的一致性，从而实现整个生产过程的高效率和经济性。

综上所述，动物细胞无血清培养基的开发与优化是朝着“无动物来源、无蛋白”的方向发展的。

经过几十年的发展，哺乳动物细胞〔如杂交瘤、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、NSO等〕无血清培养基技术已取得了可喜的进展：

Darfler等人开发了CITTL无血清培养基，以DMEM/F12(1∶1)为基础培养基，添加了5mg/L的过氧化氢酶、1.5mg/L的胰岛素、1.5～3.0mg/L的转铁蛋白、2nmol/L睾酮、0.5mg/L的二亚油酰磷脂胆碱和1.5mg/L的β-甘油磷酸，可支持sf9细胞的克隆化生长，也可用于杂交瘤细胞的培养。

Murakami等人开发了无血清培养基，以DMEM/F12(1∶1)为基础培养基，添加了5mg/L胰岛素、2～35mg/L转铁蛋白、20μmol/L乙醇胺和1nmol/L亚硒酸钠等物质，这就是现被广泛使用的DMEM/F12-ITES配方。

Kover和Frank开发了无血清培养基，以RPMI1640为基础培养基，并添加10mg/L胰岛素、5mg/L转铁蛋白、20μmol/L乙醇胺、5mg/L亚油酸、1g/L牛血清蛋白、3mg/L抗坏血酸、2μg氢化可的松和12种微量元素，可支持几种细胞的生长。

美国专利U.S.P.4927762公开了一种含有抗氧化剂的培养基，阐述了细胞在还原性介质中能更好地生长，同时指出，N-乙酰半胱氨酸、硫乳酸、巯基乙醇等物质的添加可以起到抗氧化的作用。