[发明专利]利用荧光标记酶切基因进行微生物群落结构分析的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的分析方法，具体是一种利用荧光标记酶切基 因进行微生物群落结构分析的方法。

背景技术

微生物是地球上为数最为众多的一类生物，通常以复杂群落的形式存在，并 在维系生态平衡、提供自然资源、调节宿主新陈代谢等方面发挥着重要的作用。 目前，已有大量微生物被分离、培养和鉴定。但是由于培养方法有着费时费力的 缺点以及技术上的局限性，近年来已有大量分子生物学方法被开发并应用于研究 复杂微生物群落的结构，并对研究其功能提供指导。常用的微生物分子生物学技 术包括基于分子标签(如SSU rRNA基因、ITS序列等)的分子指纹图谱技术，如变 性/温度梯度凝胶电泳(DGGE/TGGE)、单链构像多态性(SSCP)、rDNA限制性片 段多态性(ADRDA)、末端限制性酶切片段长度多态性(T-RFLP)等；以及用于全 面描述微生物群落结构和物种进化关系的克隆文库分析等。DNA指纹图技术能够 把从环境样品中PCR扩增得到的微生物群落中所有种群的特征性基因片段以指纹 图谱的形式展现出来，从而快速灵敏地检测微生态系统的动态变化，展现微生物 群落结构的多样性。

ADRDA和T-RFLP是两种目前最常用的基于限制性酶切的DNA指纹图谱技术。 ARDRA技术是通过PCR得到rDNA的基因序列混合物，用限制性内切酶进行消化， 并通过凝胶电泳获得图谱，对得到的所有限制性片段多样性进行全面分析。但基 于传统凝胶电泳技术使得其具有分辨率低、重复性差以及不便于数据统计分析等 缺点，故目前多用于对环境中分离得到的菌株进行属、种水平的分类和菌株的区 分，以及对rDNA克隆文库中的克隆进行分型和评价，仅有少数研究将其运用于分 析废水、土壤等微生物群落结构；T-RFLP技术使用5’端用荧光标记的引物来扩 增目标基因，进行限制性酶切得到酶切片段，然后用DNA测序仪对带有荧光的末 端限制性片段进行检测，从而获得代表微生物群落结构多样性的指纹图谱。依赖 于毛细管电泳技术的T-RFLP技术具有高灵敏度，高通量及高重复性的优点，且便 于多样性图谱的数字化输出和后续分析，故被广泛应用于包括土壤、水体、特殊 地质层、生物降解池以及人和动物的肠道菌群在内的各种环境中微生物群落结构 的比较分析和动态监测。但因其只对基因的末端限制性片段进行分析，故在对复 杂微生物群落进行分析的时候具有一定的局限性。它仅检测末端限制性片段长度 的多态性，因而在图谱中，同样长度的末端限制性片段可能来自几种不同的细 菌，有的在进化关系中甚至相去甚远。同时，自然环境中的微生物群落多样性往 往过于复杂，故T-RFLP图谱所反映的群落组成很难具体到种属水平，因此，在低 分类单元水平上的多样性无法体现出来，但这种多样性恰恰是很多复杂样品的特 征。运用多种限制性内切酶对同一样品进行检测，并将数据综合进行分析，可以 得到微生物群落组成的更丰富的信息，这一手段已被广泛运用于弥补上述不足。 但是，运用多种酶切不但费时费力，而且在数据处理的过程中容易引入误差。因 此，结合上述两种方法的优点，发展一种能够准确和全面地对微生物群落结构进 行分析的方法，具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的局限，提供一种利用荧光标记酶切基因进 行微生物群落结构分析的方法。本发明的方法利用了毛细管电泳的高通量、高灵 敏度和高重复性等优点，能够有效获得全面的微生物群落结构信息。

本发明是通过以下技术方案实现的，具体步骤如下：

步骤一，提取样本的基因组总DNA，扩增微生物系统发育标记基因；

步骤二，利用限制性内切酶对扩增得到的标记基因进行酶切，得到带有粘性 末端的限制性片段；

步骤三，对所有限制性片段进行末端荧光标记；

步骤四，运用DNA遗传分析仪分离并检测已被末端荧光标记的限制性片段， 得到样本的微生物组成信息图谱；

步骤五，对信息图谱进行多元变量统计学分析，获得微生物群落结构信息特 征与变化规律。

步骤二中，所述酶切具体为，采用4核苷酸识别位点的限制性内切酶对标记 基因进行酶切，获得具有粘性末端的酶切片段。

步骤三中，所述末端荧光标记具体为，使用DNA polymerase Klenow酶进行 荧光标记，标记所用的底物是与酶切后得到的粘性末端碱基互补配对的脱氧单核 苷酸。