[发明专利]一种检测异基因造血干细胞移植后供受嵌合率的方法

说明书

技术领域

本发明属分子生物学技术领域，更具体地说，涉及一种新型检测异基因造血干细胞移植后供受者嵌合率的方法。

背景技术

近年来，儿童及成人恶性血液疾病发生率有逐年上升趋势，通过常规放化疗等治疗手段，3年生存率仅有40-60％，且难以完全治愈，异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是唯一可以达到治愈的方法。目前，国内外移植例数逐年攀增，国内已开展造血干细胞移植的医院多达数十家。但allo-HSCT后的排异、复发却极大的影响了移植的成功率。移植的成功与否与移植后稳定的供受者嵌合状态的形成有着密切关系。因此，区分移植后造血干细胞的来源是评估移植成功与否的重要标志，并对判断原发病预后具有重要价值。在《Clin Oncol》杂志2004年第22期“Increasing mixed chimerism is an importantprognostic factor for unfavorable outcome in children with acute lymphoblasticleukemia after allo-geneic stem-cell transplantation：possible role forpreemptive immunotherapy”一文中就指出，移植后动态监测供受者的嵌合率可以及早发现排斥、预防复发并及时干预，具有非常重要的意义。

《中国输血杂志》2003年第16期“造血干细胞移植后植入证据检测方法的研究现状”一文指出，检测异基因造血干细胞移植后供受者嵌合率的经典方法有：(1)血型；(2)红细胞同工酶；(3)性染色体核型分析；(4)HLA抗原；(5)限制性长度多态性；(6)可变串联重复序列VNTR；(7)微卫星重复序列(STR)等，都有其固有缺点。目前国际通行的检测嵌合率的方法是STR-PCR，它有高度可区别性、敏感性和相对快速等优点，但《Blood》杂志1991年第77期“Evaluation of mixed chimerism by in vitro amplication of dinucleotide repeatsequences using the polymerase chain reaction”一文指出，它只是一种半定量的方法，有PCR竞争及平台期结果偏倚的缺点，其PCR产物需进行进一步毛细管电泳，有产物污染的可能，灵敏度只可达到5-10％左右。这些缺陷使其难以检测微小残留病灶，且PCR产物电泳及测序分析成本较高，价格昂贵的遗传测序仪在临床上用途极局限，大多送往科研机构检测，国内难以普及开展。

SNP(single nucleotide polymorphism)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，广泛用于群体遗传学和疾病相关基因的研究，将逐渐取代STR在法医鉴定、个体识别中的应用，成为新一代的分子遗传学标记。

实时定量PCR(RQ-PCR)是一种将常规聚合酶链反应(PCR)与特异性的探针杂交技术融合的技术，它成功解决了常规PCR不能定量、扩增产物污染的假阳性、需要进行PCR后处理等问题，具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，且实时定量PCR仪可以进行白血病融合基因、甲基化、点突变及移植患者巨细胞病毒、真菌等定量检测，在血液科具有极高的临床应用价值。

《Blood》杂志2002年第99期“Quantitative assessment of hematopoieticchimerism after bone marrow transplantation by real-time quantitative polymerasechain reaction”一文报道了RQ-PCR联合SNP检测移植后嵌合率的方法，较STR-PCR极大的提高了检测的灵敏度、准确性，但需利用供受者的细胞模拟供受嵌合进行倍比稀释建立标准曲线，这种方法建立的标准曲线需要利用大量的移植前的宝贵标本，操作繁琐，增加了检测成本及时间，并且降低了实验的稳定性。本发明利用质粒标准品建立标准曲线、进行绝对定量，质粒有性质稳定、易于保存、定量准确、可无限量扩增的优点，不浪费血样，极大提高了结果的准确性及可靠性。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便易行、节约成本的检测异基因造血干细胞移植后供受嵌合率的新方法。