[发明专利]比色法测定奶粉中游离L-羟脯氨酸

说明书

技术领域

本发明涉及奶粉中游离L-羟脯氨酸含量的测定。

背景技术

L-羟脯氨酸(L-HYP)是人体胶原蛋白的组成成分，但不属于20种常见的氨基酸。我国最近出台的《食品添加剂使用卫生标准2760-2007》并不允许其作为食品添加剂添加到各类食品中。但一些企业为了追求利润，以次充好，使自己产品的蛋白质含量达标而在生产奶粉利含乳饮料过程中非法添加了游离L-HYP，蒙混通过质量监管部门的监督检查而在市场上销售，这种劣质的乳制品将严重危及到人体健康。L-HYP的测定主要包括比色法、氨基酸分析仪法和电泳法等，其中以比色法最为常用。我国于1990年将比色法定为《肉与肉制品L-羟脯氨酸含量测定》的国家标准方法，并且一直沿用至今。但遗憾的是，目前还未出现对奶粉中游离L-HYP进行测定的方法。

发明内容

本发明专利的目的在于提供一种快速测定奶粉中游离L-羟脯氨酸含量的方法。

本发明专利包括对奶粉中蛋白质进行沉淀处理，然后采用经典的比色法对其中的游离L-HYP进行测定获得相关结果。

作为本发明专利的特征，蛋白质沉淀剂为219g/L乙酸锌和106g/L亚铁氰化钾。

作为本发明专利的特征，显色剂为对二氨基苯甲醛。

本发明专利所建立的方法，实验的精密度在2.6％-4.9％之间，完全可以满足定量分析的需要，表明用此方法测定奶粉中的游离L-HYP是可行的。此外，实验操作简单、快捷、并且检测成本低。

具体实施方式

准备好主要仪器，包括紫外可见分光光度计、电热恒温水浴锅和电子天平。称取L-HYP标准品若干克待用。蛋白质沉淀剂包括219g/L乙酸锌(称取219g醋酸锌，加30ml冰醋酸，溶于水并定容至1000ml)和106g/L亚铁氰化钾(称取106g亚铁氰化钾溶于水，并定容至1000mL)。缓冲溶液(pH 6)：称取50.0g柠檬酸，26.3g氢氧化钠和146.1g乙酸钠，蒸馏水溶解，定容至1000mL。再加入200mL蒸馏水和300mL正丙醇，混匀，保存。氯胺T溶液(此溶液现用现配)：称取1.41g氯胺T溶解10mL蒸馏水，依次加入10mL正丙醇和80mLpH6缓冲液。显色剂(此溶液现用现配)：称取10.09对二氨基苯甲醛，35mL高氯酸溶解，混匀后缓慢加人65mL异丙醇。

配制L-HYP标准贮备液(500μg/mL)：准确称取L-HYP标准品0.2500g，加入1滴1mol/L盐酸溶解，蒸馏水定容至500mL，4℃冰箱保存。标准曲线工作母液配制(现用现配)：分别吸取500μg/mL L-HYP标准贮备液0、0.5、1、2、4、6、8mL至100mL容量瓶，定容至100mL，得到浓度分别为0、2.5、5、10、20、30、40μg/mL的L-HYP标准曲线工作母液。以蒸馏水为空白，吸取L-HYP标准工作母液1mL，加入氯胺T2mL溶液，充分混匀后室温条件下反应20min后，加入显色剂2mL，于60℃水浴恒温反应20min，迅速冷却至室温后定容至25ml，558nm测定吸光度。以L-HYP浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求出回归方程和相关系数。

准确称取20g奶粉(精确至0.0001g)于250mL容量瓶中，边转动容量瓶边加入亚铁氰化钾溶液20ml，摇匀后，再加入醋酸锌溶液20ml，以沉淀蛋白质。然后，加水至刻度，混匀，放置半小时后，弃去上层脂肪，清液用滤纸或脱脂棉过滤，弃去初滤液5～10ml，滤液备用。从制备好的待测液中吸取2mL于25mL具塞试管。吸取待测液1mL，加入氯胺T2mL溶液，充分混匀后室温条件下反应20min后，加入显色剂2mL，于60℃水浴恒温反应20min，迅速冷却至室温后定容至25ml，以蒸馏水为空白，558nm测定吸光度。每个样品做3次重复。将吸光度代人回归方程求出羟脯氨酸含量。