[发明专利]雷莫拉宁的分离方法

说明书

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种分离雷莫拉宁的方法。

背景技术

随着抗生素在抗感染治疗上的大量应用，临床耐药问题日益突出。雷莫拉宁(RAMOPLANIN)作为一类新型广谱抗革兰氏阳性菌抗生素，目前主要是作为外用和治疗胃肠道粘膜表面感染性疾病药物进行研究开发。

雷莫拉宁由一种游动放线菌属菌种(美国标准菌库保存，代码ATCC33076)制得。雷莫拉宁传统的分离方法是将雷莫拉宁发酵菌株发酵出来的发酵液先调pH到3.5，离心得到菌丝体和发酵液，其中菌丝体用有机溶剂浸泡半小时后离心去上清液，将上清液真空浓缩，再用正丁醇萃取多次，合并萃取液后再反复用石油醚对其进行沉淀并分离出来，真空干燥得到粗品，发酵液也同样制得粗品。将粗品预处理后再湿法上硅胶柱纯化，用不同极性的溶剂作为流动相洗柱子，得到纯度较高的雷莫拉宁纯品。

USP4328316报道的雷莫拉宁的分离方法主要是用硅胶柱层析，通过调整展开剂的极性来分离得到高纯度的雷莫拉宁，但此法的缺点是操作过程繁琐，硅胶柱层析速度较慢，样品处理量少，难以实现大规模的工业生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够实现大规模的工业生产并同时保持其高收率和高纯度的雷莫拉宁的分离方法。

本发明的雷莫拉宁的分离方法依次包括如下步骤：

a)雷莫拉宁上柱液上大孔离子交换吸附树脂；

b)用水冲洗；

c)用甲醇水溶液洗脱；

d)用含酸的甲醇水溶液洗脱。

本发明所述的由保藏号为ATCC33076的发酵菌株进行发酵的过程如下：

斜面培养条件：斜面及平板培养基(g/L)：牛肉膏3.0，酪蛋白10.0，可溶淀粉24.0，葡萄糖1.0，琼脂22.0，灭菌前pH 7.0，121℃灭菌30min。菌种接种于斜面培养基，于30℃培养5-9天。

种子培养条件：二级发酵种子培养条件为：牛肉膏3.0，酪蛋白5.0，酵母粉5.0，燕麦粉30.0，碳酸钙4.0，自来水配制，用2mol/L的氢氧化钠(或者盐酸)调pH至7.0，121℃灭菌30min。种子培养基装量为100ml/750ml，于28℃，250rpm的旋转式摇床培养72h。

发酵培养条件为：淀粉50.0，葡萄糖20.0，黄豆粉30.0，碳酸钙10.0，L-Leu5.0，自来水配制，用2mol/L的氢氧化钠(或者盐酸)调pH至7.0，121℃灭菌30min。接种量6％，装量100ml/750ml，于25℃，旋转式摇床250rpm培养5天。

将发酵产物先用草酸调pH到3.5，离心得到菌丝体和发酵液，其中发酵液直接浓缩得到浓缩液，而菌丝体用有机溶剂浸泡半小时后离心去上清液，将上清液浓缩后得到浓缩液。本发明所述的雷莫拉宁浓缩液可以是上述两种浓缩液的任意一种或其混合物。

取大孔离子交换吸附树脂(对于此类型的树脂可以通用)，再生好后装入层析柱，将雷莫拉宁浓缩液加水稀释制成雷莫拉宁上柱液。加水的标准是含水量大于50％即可。

然后将雷莫拉宁溶液中等流速上柱，上柱后先用大量(优选柱体积的8倍或以上)的水(优选去离子水或蒸馏水)冲洗，除去大量的盐；再用甲醇水溶液中等流速进行洗脱，在此条件下，大量的极性色素和其他杂质被洗下，而雷莫拉宁被保留在柱上；再用含酸的甲醇水溶液中等流速进行洗脱，此时大量的雷莫拉宁被洗脱下来，而极性较低的杂质仍然被留在柱上，取纯度大于80％的部分。

根据本发明的方法，其中所述大孔离子交换吸附树脂为YPR Ⅱ型或Dowex50型。

根据本发明的方法，其中所述甲醇水溶液的浓度为甲醇∶水＝2∶1～3∶1，优选使用70％的甲醇水溶液。

根据本发明的方法，其中所述含酸的甲醇水溶液为含盐酸、醋酸或硝酸的甲醇水溶液，优选所述含酸的甲醇水溶液为含盐酸的甲醇水溶液。

根据本发明的方法，其中所述含酸的甲醇水溶液中酸的浓度优选为0.1N～0.5N，优选0.2N。一般来说，酸的浓度在0.01N以上，都能达到与硅胶法相当的效果，但从收率和纯度综合考虑，优选将酸的浓度定在0.1N～0.5N的范围。

本发明的雷莫拉宁的分离方法用可以实现工业化的大孔离子交换树脂来代替硅胶，通过吸附洗脱条件的摸索，建立了一条稳定的分离纯化工艺，将雷莫拉宁的纯度大幅度的提高。由于所用树脂价格便宜，再生性能好，完全能够实现大规模的工业生产。

具体实施方式

实施例1～2考察洗脱时甲醇水溶液浓度的影响

实施例1