[发明专利]采用转喜树aoc基因提高喜树愈伤组织中喜树碱含量的方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种提高喜树愈伤组织中喜树碱含量的方法，特别是一种采用转化丙二稀氧化物环化酶基因(allene oxide cyclase，aoc)提高喜树愈伤组织中喜树碱含量的方法。

背景技术

喜树(Camptotheca acuminata Decaisne)，蓝果树科(Nyssaceae)喜树属多年生亚热带落叶阔叶树，别名有旱莲木、干丈树等，此属仅喜树1种植物，是我国特有树种(中国科学院中国植物志编辑委员会，1983)。自20世纪90年代来，美国、日本、加拿大和英国等国家积极投入大量人力物力进行喜树引种和栽培等的研究和喜树碱开发，喜树成为红豆杉(Taxus sp。)之后第2个重要的木本抗癌药用植物(Wallis，Wang et al.1997)。至此，已从喜树中分离出20多种化学成分，其中喜树碱及其类似物有8种，它们的共同点是结构中都拥有5个环。其中，10-羟基喜树碱(hydroxy-camptothecin，HCPT)是喜树碱分子的第10位碳原子的氢被羟基取代后的喜树碱的天然衍生物，来源于喜树的果实、叶，也可由喜树碱人工化学转化而来，为黄色柱状结晶、不溶于水，微溶于有机溶剂、溶液，具有蓝色荧光，其钠盐溶于水。该化合物具有显著的抗癌活性，较喜树碱剂量小、毒性轻、抗瘤广谱。从目前的研究情况和研究趋势来看，喜树碱及类似物主要从喜树中分离获得(Sriram，Yogeeswari et al.2005)。而喜树碱作为喜树中的一种天然次生代谢产物，其产量受到喜树生长发育和环境因素的影响，而过去人们一直着力于提取工艺和产品的开发，随着喜树碱市场的扩大，生产喜树碱及其类似物所需的原料将成为这一产业的瓶颈。据报道，中国国内每年新发现癌症患者160万人，并有130万人死于癌症，全世界的癌症患者将会更多。但现今全世界的喜树碱的生产能力仅为600kg，远远不能满足市场的需要，而且喜树碱仍不能化学全合成，所以喜树资源仍是喜树碱及其类似物的唯一来源。喜树愈伤组织和细胞培养系统则为生产喜树碱带来了新的希望。

喜树碱(camptothecin，简称CPT)是一种具有抗肿瘤活性的萜类吲哚生物碱。经对现有技术的文献检索发现，国内外科学家尝试了采用各种方法，包括优化培养条件(Helmut Wiedenfeld，et al.Camptothecin and 10-hydroxycamptothecin in callus and plantlets of Camptotheca acuminata.Plant Cell Tissue and Organ Culture，1997，49：213-218.Xue-Wu Pan，et al.Improvement of growth and camptothecin yield by altering nitrogen source supply in cell suspension cultures of Camptotheca acuminata.Biotechnology Letters，2004，26：1745-1748)、加入前体物质(Andrea Silvestrini，et al.Effects of alkaloid precursor feeding on Camptotheca acuminata.Physiology and Biochemistry，2002，40：749-753)及转化发根(Lorence A，et al.Camptothecin and 10-hydroxy-camptothecin from Camptotheca acuminatahairy roots.Plant Cell Reports，2004，22：437-441)来提高喜树组织培养物中喜树碱的含量。如Wiedenfeld等对喜树组织培养的培养基条件进行了研究，比较了不同的激素配比和培养基类型，选择了MS培养基和1.0mg/Lα-萘乙酸、1.0mg/L激动素和60mg/L蔗糖作为最优培养条件，发现体外培养的所有组织和器官中都含有喜树碱和10-羟基喜树碱，喜树愈伤中喜树碱含量变化范围从2.36mg/g到1.49mg/g干重。而Lorence等建立了利用发根农杆菌ATCC15834和A4遗传转化喜树的体系，获得了毛状根，其中喜树碱最高含量为1.0mg/g干重.