[发明专利]HBVcccDNA核酸定量检测试剂盒及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及核酸检测试剂盒，具体涉及荧光PCR法HBV cccDNA核酸定量检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

HBVcccDNA(共价闭合环状乙型肝炎病毒)是乙型肝炎病毒在人的肝细胞核中存在的形式。当乙型肝炎病毒(HBV)进入人体后，随血液循环进入肝脏侵入肝细胞。病毒进入肝细胞后，其蛋白成分留在细胞外，其DNA直接进入人的肝细胞核，通过人体的RNA聚合酶II将其负链的缺口修补成为完整的环，然后折叠成超螺旋结构，就成为共价(covalence)、闭合(close)、环状(cycle)的DNA，取三个英文字头，即为cccDNA。cccDNA又是制造乙型肝炎病毒的模板，而且又长时间躲在肝细胞核内，不容易清除，所以有的带毒者即使是血清内的HBV DNA已经消失，但其肝细胞核内尚有cccDNA存在，它就会继续制造HBV DNA和乙肝病毒抗原，装配成乙肝病毒(HBV)入血，使乙型肝炎带毒者血清内又现HBV DNA及各种抗原阳性。所以它是使得乙型肝炎带毒者长期携带病毒，而不能轻易治愈的罪魁祸首。也就是说，HBV cccDNA实际是乙型肝炎病毒携带者的一个看不见打不着的最隐蔽的敌人。因此检测HBV cccDNA对乙型肝炎的治疗有着重大意义。

过去报道检测HBVcccDNA的方法并不适合临床检测使用，因为这些方法需要涉及凝胶电泳、核酸转膜、同位素探针杂交、多次洗涤、同位素成像等程序。操作人员很难掌握每一个技术环节和操作细节，实验的重复性也不好，而且费时。经典方法Southern blot的定量范围和灵敏度也非常有限。

实时荧光定量PCR技术使基因扩增、分子杂交和光化学融为一体。PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，并通过微机控制，实现了对PCR扩增产物进行实时动态检测和结果自动分析。Taqman荧光PCR技术是在常规PCR技术基础上添加了一条荧光双标记的探针，一个标记在探针的5’端，称为荧光报告基因(R)，另一个标记在探针的3’端，称为荧光淬灭基因(Q)，两者可构成能量传递结构，即5’端荧光基因所发出的荧光可被另一荧光基因吸收或者抑制。探针的3’端羟基(-OH)已被去除或者封闭，不具有延伸能力。探针在无特异性PCR发生时，荧光信号不改变。当有特异性PCR扩增发生时，探针会在PCR过程中被Taq酶的5’--3’外切酶活性作用而切断，抑制作用消失，从而引起报告基因荧光信号增长。随着PCR的过程的进行，荧光信号伴PCR产物的增长而增长。荧光PCR就是利用此原理，在PCR反应前后，分析检测反应中特定荧光信号的变化，得到信号增强值，再利用试验确定的信号增强阐值，即可以判别样品的阴阳性。荧光检测所获得Ct值(cycle threshold)与扩增前样品中模板数对数值成线形负相关。据此建立标准曲线，可以定量分析样品中目的基因数量。

实时荧光定量PCR方法虽然非常灵敏，而且操作简便，但是关键点在于，必须把HBVcccDNA和其他非cccDNA形态区分开，否则失去特异性检测HBV cccDNA的价值，但现有技术中尚缺乏这样的设计。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测共价闭合环状乙型肝炎病毒(HBVcccDNA)核酸定量检测试剂盒(荧光PCR法)及其制备方法与应用，解决了现有技术检测HBVcccDNA难的难题，为临床诊断病人提供依据。

本发明的检测原理：

HBVcccDNA与Dane颗粒中DNA以及病毒其他复制中间体核酸形式是有区别的，根本区在于HBVcccDNA是完整的DNA双链，而HBV非cccDNA核酸形态在DR1和DR2区域附近存在缺口。利用该区别点，建立一种选择性检测HBVcccDNA的方法。本发明利用非cccDNA在DR1和DR2区域存在的一个断端的特点，设计一条由两种无同源性序列组成的引物，引物3’端与HBV核酸断端前的部分序列互补配对，做单链延伸反应，生成一条5’端带有无关序列的HBV单链，再以此无关序列作为下一个PCR反应的引物，以保证后面PCR扩增的模板仅来源与5’端带有无关序列的HBV单链。由于非cccDNA在DR1和DR2处有断端，所以单链无法有效延伸，致使后面PCR中，HBV特异性引物无法与新单链结合，也就不能形成PCR过程中指数扩增。这样就有效区分了HBV cccDNA和其他非cccDNA。