[发明专利]有效降解内皮素-1 mRNA的脱氧核酶及其在减轻急性缺血性心律失常中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及基础医学及生理学领域，具体涉及一类脱氧核酶，其具有降解ET-1mRNA和减轻急性缺血性心律失常的作用。

背景技术

内皮素(endothelin，ET)是一种强烈的缩血管肽，其家族包括ET-1，ET-2，ET-3及ET-4四种异构肽。ET各异构肽的基因除染色体定位及序列不同外，其表达过程相似。ET基因转录出mRNA，后者进入胞浆，在核糖体的作用下，翻译产生前内皮素原(prepro ET，ppET)，ppET在双氨基酸内切酶作用下生成前内皮素(preET)或称大内皮素(big ET)，其后在不同的酶作用下形成21个氨基酸或31个氨基酸组成的成熟ET。目前在哺乳动物克隆的ET受体分ET_A及ET_B两种亚型，均为G蛋白偶联受体，在心血管系统中广泛分布，ET在心血管系统中主要以ET-1的形式广泛分布，通过旁/自分泌方式发挥效应，对心血管系统的发育、血管舒缩及心脏的电及机械活动等具有广泛的调节作用。心肌缺血可诱导ET-1的释放及合成增加，其在心肌缺血损伤中作用复杂。目前对ET-1在心肌缺血中的作用仍有争议，有报道表明外源性ET-1即可引起急性缺血性心律失常、损伤心肌组织，阻断其受体可预防或减轻急性缺血性心律失常的发生，亦可对缺血心肌产生保护作用，而对内源性ET-1在急性缺血性心律失常中作用的研究仍较少。本发明人曾用ET-1反义寡核昔酸成功减轻或预防结扎大鼠冠状动脉左前降支引起的心律失常，但反义寡核昔酸骨架多阴离子性质导致非特异性作用，诱导RNase H切割作用和核酸酶抗性还不够高及毒副作用较大等不足。本工作希望通过设计有效ET-1脱氧核酶直接抑制ET-1表达，进一步明确在急性缺血性心律失常时，过表达的ET-1是否是引起急性缺血性心律失常的主要活性物质。

在人基因治疗中，反义核酸技术已经是使其不希望的基因失活所选择的主要工具。反义途径采用与编码不希望表达的基因的mRNA分子互补，这样的杂交导致基因表达的抑制。

反义技术有一些缺点。反义杂交导致形成DNA/靶mRNA异源双链。该异源双链作为RNAse H介导的靶mRNA成分降解的底物。这里，DNA反义分子的作用方式是被动的，因为它仅仅促进内源RNAs eH酶所需的裂解。考虑反义分子与它们的靶mRNA形成稳定的异源双链的化学和能力，这种对RNAse H的依赖性使反义分子的设计受到限制。反义DNA分子也存在与非特异活性和更高浓度时甚至是毒性相关的问题。

作为除反义分子之外的另一个选择，催化性核酸分子已经表现出作为抑制基因表达的治疗剂的前景，在文献中已经有广泛的讨论。所以，与常规反义分子不同，催化性核酸分子通过真正裂解其靶mRNA分子而不是仅仅与之结合而起作用。如果靶序列符合某些最低要求，催化性核酸分子能够仅裂解靶核酸序列。靶序列必需与催化性核酸的杂交区互补，而且靶必需在裂解位点含有特异序列。

催化性RNA分子(“核酶”)已经有许多报道，并且被证实能够裂解RNA和DNA分子。事实上，体外选择和进化技术的发展已经使使用已知核酶的随机变体或随机RNA序列作为起始点得到针对已知底物的新的核酶成为可能。

“脱氧核酶”作为一类新的催化分子，是单链的，可裂解RNA的。且已经提出脱氧核酶的一般模型，称为“10-23”模型。依照“10-23”模型的脱氧核酶，也简单地称之为“10-23脱氧核酶”，具有15个脱氧核糖核苷酸的催化域，与两个底物识别域侧接。体外分析表明，这一类型的脱氧核酶在生理条件下有效地在嘌昤：嘧啶接合处裂解其底物RNA。

10-23脱氧核酶是一类具有切割活性的单链DNA分子，通过改变底物结合区核苷酸序列，可与特定mRNA底物结合，切断特定的磷酸二酯键，抑制基因表达。本发明拟采用ET-1全长cDNA体外转录的RNA作为底物，在体外筛选高效的ET-1mRNA的10-23脱氧核酶，为进一步明确内源性ET-1在急性缺血性心律失常中的作用提供工具，也为解释急性缺血性心律失常的发生机制及急性缺血性心律失常的防治与新药开发提供理论依据和新思路。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一类特异性地裂解ET-1mRNA的脱氧核酶，所述脱氧核酶包括

(1)在嘌呤：嘧啶裂解位点裂解mRNA的催化域；

(2)与催化域的5’末端邻接的第一结合域：和

(3)与催化域的3’末端邻接的第二结合域，

其中结合域与紧密侧接ET-1mRNA的如SEQ ID No：1所示的核苷酸1到1385的区内的嘌呤：嘧啶裂解位点的两个区充分互补，以至于脱氧核酶裂解ET-1mRNA。