[发明专利]体外刺激树突状细胞成熟的方法

说明书

一，技术领域

本发明属于医药领域，具体而言，本发明涉及用胶质瘤干细胞样抗原体外刺 激树突状细胞成熟的方法。另外，本发明还涉及由此制备的成熟的树突状细胞在 治疗药物方面的应用、以及胶质瘤干细胞样抗原的制备方法和其应用等。

二，背景技术

胶质瘤(glioma)是中枢神经系统最常见的肿瘤，其中恶性者(WHOIII、IV 级)治愈率低，复发率高，预后差。由于大多数胶质瘤呈浸润性生长，与正常组 织无明显分界，所以单靠手术无法根治。虽然术后辅助化疗、放疗，但效果仍不 理想，恶性胶质瘤的中位生存期仅51周，需要进一步研究寻找更有效的治疗方 案。

以往认为中枢神经系统是免疫豁免区，但近年来的研究表明中枢神经系统不 但存在着树突状细胞(dendritic cell)，而且抗瘤效果明显，尤其是小胶质细胞 在其中发挥了重要作用。例如，Fischer等人将小鼠的脑组织与GM-CSF一起培 养，从中得到了依赖于星形细胞的具有良好的抗原提呈功能的树突状细胞。肖保 国等人发现体外培养神经系统的小胶质细胞在GM-CSF的刺激下可以转变为树 突状细胞样细胞。

树突状细胞是目前已知最强的抗原递呈细胞，具有启动初次免疫应答的能 力，在抗肿瘤免疫治疗中具有重要地位。中国专利申请CN101090633A公开了用 未成熟的树突状细胞来治疗肿瘤的方法，但是更多的报道是用成熟的树突状细胞 来用于治疗。例如，中国专利申请CN1462195A公开了用成熟的树突状细胞治疗 I型糖尿病、类风湿性关节炎等自身免疫疾病，其中成熟的树突状细胞是通过 IFN-gamma、TNF-alfa、TGF-beta、IL-10等细胞因子体外刺激未成熟的树突状细 胞而制备得到的。中国专利申请CN1738619A也公开了用体外部分成熟的树突状 细胞治疗患者结肠癌等肿瘤的方法，其中树突状细胞的部分成熟是在卡介苗、干 扰素、脂多糖、肿瘤坏死因子等细胞成熟剂的刺激下完成的，在其实施例1中仅 披露了与PKH67-A549肿瘤细胞，而不是与肿瘤相关抗原混合孵育。

中国专利CN1141975C公开了一种肿瘤相关抗原的制备方法，包括破碎、灭 活肿瘤细胞，然后提取可溶性抗原蛋白，其中没有提示要使用X射线来处理肿 瘤细胞抗原的步骤，也没有提示将其用于体外刺激未成熟的树突状细胞成熟而进 行治疗。中国专利CN100392074C公开了电穿孔导入针对肝癌等的肿瘤抗原 mRNA来刺激树突状细胞成熟的方法，该方法没有提示使用X射线来处理肿瘤 相关抗原，相反还优选提示对成熟的树突状细胞进行灭活。中国专利申请 CN1471575A公开了一种冷藏成熟的树突状细胞的方法，优选未成熟的树突状细 胞是从CD14+或CD34+细胞制备的，但是没有提示处理肿瘤相关抗原的步骤。 目前国内外研究的焦点绝大多数还集中在非干细胞样抗原。Pellegatta等人提出 了一种制备肿瘤相关抗原的方法(Cancer Res.2006，66(21)：10247-10252)，但是没 有提出分选诸如CD133+或A2B5+等干细胞样细胞的步骤，更没有提示包括X 射线处理肿瘤相关抗原的步骤。

然而，胶质瘤具有一定的免疫逃避特性是目前胶质瘤免疫治疗效果不满意的 主要根源。究其原因，我们认为与胶质瘤干细胞样细胞(stem-like cell)有因果 关系。胶质瘤干细胞样细胞免疫原性弱，遗传性状高度不稳定，可通过突变而丧 失肿瘤抗原，或通过肿瘤细胞等位基因缺失或表达下调而降低肿瘤抗原量，从而 抑制了肿瘤细胞表面抗原的递呈。因此，上述现有技术会受困于胶质瘤的免疫逃 避特性而效果不理想。

针对现有技术中存在的缺陷，经过长期艰苦的研究，本发明人提出了一种新 的体外刺激能用于治疗胶质瘤的树突状细胞成熟的方法，其中未成熟的树突状细 胞与由胶质瘤干细胞样细胞经X射线处理制备得到的相应肿瘤相关抗原一起孵 育，由此制得的树突状细胞能够显著提高其介导的CTL杀伤效果，从而提高胶 质瘤的治疗效果；另外，本发明人优选出其中胶质瘤细胞的培养和收集方法，收 集的胶质瘤干细胞样细胞(如CD133+或A2B5+细胞)制备而成的相应肿瘤相关 抗原，最终也能通过与树突状细胞孵育，而进一步提高CTL杀伤效果。除了胶 质瘤疗效改进之外，本发明还具有操作简便易行、成本较低、质量稳定等优点。

三，发明内容