[发明专利]一种检测庆大霉素的直接竞争酶联免疫测定试剂盒

权利要求书

1.本发明公开一种测定庆大霉素的直接竞争酶联免疫测定试剂盒。

其特征包括：免疫原的制备，酶标抗原的制备，抗体制备和试剂盒各组份的配制及酶标板的包被。

2.根据权利1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，合成庆大霉素免疫原的方法。主要是用2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲溶液为溶剂，用水溶性碳二亚胺{1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺(EDAC)；或1-环己-3-(2-玛啉-4-乙基)碳二亚胺对甲基苯亚磺酸盐(CMEC)，为交联剂，首先活化载体蛋白分子中游离羧基，再与庆大霉素分子中的游离氨基相连，生成免疫原。载体蛋白如：牛血清白蛋白，卵清蛋白，甲状腺球蛋白，大钥匙孔状槭血蓝蛋白。

3.根据权利1，2所述，本发明公开庆大霉素与酶交联的的方法.交联的酶包括：辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶等。这几种酶与庆大霉素交联都可以采取2.所述的庆大霉素与载体蛋白相交联的方法，即用水溶性碳二亚胺活化酶分子中的游离羧基，再与庆大霉素分子中的游离氨基相连，生成酶标抗原.此外，分子表面含糖链的酶，如辣根过氧化物酶，尚可用过碘酸氧化法合成酶标抗原.此交联方法的特征在于，用过碘酸钠氧化辣根过氧化物酶分子表面的糖链，生成游离醛基，与庆大霉素分子上的氨基相连，以制备的酶标抗原.首先用过碘酸钠氧化辣根过氧化物酶，在冰浴中，避光搅拌15～30分钟.加入乙二醇后.立即过Sephadex G 25柱，用0.01M PBS液洗脱，以除去过量的氧化剂.庆大霉素溶于蒸馏水中，滴入上收集的过碘酸氧化的HRP中.用1M NaOH调PH至9～10，室温轻柔搅拌3小时.加入新配制的0.1M四氢硼钠(NaBH₄).室温搅拌30分钟.用1.0M NaH2PO4调PH至6，再加入0.1M四氢硼钠(NaBH₄).室温搅拌30分钟.过Sephadex G-25柱收集有色峰.为庆大霉素-HRP.

4.根据权利1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，试剂盒溶液的优化配制：标准溶液和样品的配制，是用含0.05％～0.1％吐温-20的0.1～0.01M的磷酸盐缓冲溶液。抗体稀释液用含0.1～0.5％明胶的0.1～0.01M磷酸盐缓冲溶液。显色液为二组份，其中，一组份为显色缓冲液，由磷酸氢二钠和柠檬酸组成，每毫升含0.2～0.5μl 30％H₂O₂；另一组份为四甲基联苯胺(TMB)液。TMB液用95％乙醇或二甲亚砜配制成1mg/ml浓度。

5.根据权利1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，用采用羊抗兔抗体(二抗)包被96或48孔酶标板。用2％卵清蛋白液封闭孔中未吸附二抗的部位。

6.根据权利1～5所述的酶联免疫试剂盒，是一种用直接竞争酶联免疫测定方法，测定各种样品中庆大霉素。其特征在于：

(1)样品的前处理方法。用加热法去蛋白，用有机溶剂去脂，水相稀释就可测定。大大简化了前处理过程。

(2)用权利1-5所述工艺组装的试剂盒测定，检测过程为：

用包被有羊抗兔抗体的酶标板，加入庆大霉素抗体，孵育后洗涤甩干，加入标准或样品溶液和酶标抗原(庆大霉素-辣根过氧化物酶)，孵育后洗涤甩干，加显色剂显色，终止，测定。标准或样品庆大霉素浓度的对数值与OD₄₅₀值呈反比。以此达到定量测定庆大霉素的目的。此直接竞争酶联免疫测定试剂盒，检测范围为1～80ng/ml，灵敏度可达0.5ng/ml。