[发明专利]一种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法和应用无效
| 申请号： | 200910044070.6 | 申请日： | 2009-08-10 |
| 公开（公告）号： | CN101659962A | 公开（公告）日： | 2010-03-03 |
| 发明（设计）人： | 丁德馨;李广悦;王永东;刘劼;刘玉龙;胡南;王有团 | 申请（专利权）人： | 南华大学 |
| 主分类号： | C12N15/74 | 分类号： | C12N15/74;C22B3/18;C22B60/02;C12R1/01 |
| 代理公司： | 湖南省国防科学技术工业办公室专利中心 | 代理人： | 冯 青 |
| 地址： | 421001湖南省衡阳市常*** | 国省代码： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 生长 速度 耐热 能力强 氧化 亚铁 杆菌 基因工程 菌株 制备 方法 应用 | ||
1、一种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法，其特征在于用pJRD215-PT载体在氧化亚铁硫杆菌QEY-6中融合表达rpf、cc3302和ssh10b基因，包括：(1)氧化亚铁硫杆菌QEY-6和大肠杆菌S17-1(pJRD215-PT-rcs)的培养；(2)接合转移；(3)阳性克隆筛选；该菌株为氧化亚铁硫杆菌Acidithiobacillusferrooxidans QEY-6(pJRD215-PT-rcs)，CCTCC M 209156。
2、根据权利要求1所述的一种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法，其特征在于该制备方法包括下列步骤：
A、pQE30的T5启动子和T0终止子的扩增，并与pJRD215一起构建穿梭表达载体pJRD215-PT：以pQE30质粒为模板，根据T5启动子、T0终止子和穿梭质粒pJRD215上的克隆位点设计引物，回收PCR片段与酶切后的pJRD215连接得到pJRD215-PT并转化大肠杆菌JM109；
B、藤黄微球菌rpf基因、新月柄杆菌cc3302基因和芝田硫化叶菌ssh10b基因的扩增并克隆至T载体：根据藤黄微球菌rpf基因、新月柄杆菌cc3302基因和芝田硫化叶菌ssh10b基因和pJRD215-PT的酶切位点设计引物扩增片段，回收PCR产物，并分别克隆至pMD18-T载体，将这些重组载体分别转化大肠杆菌JM109；
C、重组穿梭表达载体pJRD215-PT-rcs的构建：提取pMD18-T-rpf、pMD18-T-cc3302和pMD18-T-ssh10b，以pMD18-T-cc3302和pMD18-T-ssh10b为模板，扩增cc3302-ssh10b融合基因，回收扩增片段后与pMD18-T连接得到pMD18-T-cs，再以pMD18-T-cs和pMD18-T-rpf为模板扩增得到rpf-cc3302-ssh10b融合基因片段，并克隆于pMD18-T载体，最后亚克隆至pJRD215-PT载体得到pJRD215-PT-rcs，转化至大肠杆菌S17-1；
D、融合表达rpf、cc3302和ssh10b基因的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株的构建：培养氧化亚铁硫杆菌QEY-6和大肠杆菌S17-1(pJRD215-PT-rcs)，用接合转移的方法将pJRD215-PT-rcs转入氧化亚铁硫杆菌QEY-6，得到氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株Acidithiobacillus ferrooxidans QEY-6(pJRD215-PT-rcs)。
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