[发明专利]基于单链核酸外切酶末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的生物传感技术

说明书

技术领域

本发明属于一种检测有机小分子与结合蛋白相互作用的生物传感技术，具体是指末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白的相互作用及核酸外切酶I保护分析。

背景技术

有机小分子与结合蛋白相互作用、药物与化学毒素等有机小分子以及小分子结合蛋白的快速筛查与检测对于临床诊断、医学研究、食品与公共安全、药物筛选、环境监测等领域具有极其重要的意义。目前常用的有机小分子与结合蛋白相互作用的检测技术主要有表面等离子共振、酶互补片断免疫分析以及荧光各向异性分析等。这些检测技术灵敏度不高、可靠性差，且需要精密的仪器，不能满足准确快速检测的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出一种基于单链核酸外切酶末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的生物传感技术，它可实现多目标同时检测，并且操作简便、快速、灵敏。

本发明的技术方案是，所述基于单链核酸外切酶末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的生物传感技术为：利用末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白相互作用后的核酸外切酶I的保护分析，通过被保护的单链寡核苷酸探针的定量分析来检测小分子与蛋白的相互作用以及小分子或其结合蛋白。

以下对本发明做出进一步说明。

所述末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白的相互作用及核酸外切酶I保护分析为：

对于小分子与其结合蛋白的相互作用，检测步骤是：取所述有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链的储备液置于微量管中；再于微量管中加入包含小分子结合蛋白的样品溶液；然后加入核酸外切酶I反应，得末端保护反应的产物；

对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测步骤：取所述有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链的储备液置于微量管中；再加入包含待测小分子的样品溶液，混合均匀后加入小分子结合蛋白或单克隆抗体溶液；再加入核酸外切酶I，得末端保护反应的产物；

本发明中，末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链可以经现有的交联反应技术实现。例如，对于带有羧基的有机小分子，可以采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺与琥珀酰亚胺交联反应技术与3’端NH₂标记的寡核苷酸DNA单链进行交联；对于带氨基的有机小分子，可以采用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯的交联反应技术与与3’端标记有巯基的寡核苷酸DNA单链进行交联。交联反应产物可用透析纯化。

进一步地，本发明中，末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白的相互作用及核酸外切酶I保护分析为：

对于小分子与其结合蛋白的相互作用，检测步骤是：取5μl所述有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链的储备液置于微量管中，加入1.5μl 10×核酸外切酶I反应缓冲溶液，该缓冲溶液为67mM Glycine-KOH，6.7mM MgCL2，10mM 2-巯基乙醇pH9.5；再于微量管中加入8μl包含小分子结合蛋白的样品溶液，在37℃恒温反应0.5h；然后加入0.5μl核酸外切酶I，置于37℃反应5分钟；之后升温至80℃反应20分钟，进行热灭活以终止酶反应，得末端保护反应的产物。

对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测步骤：取5μl所述有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链的储备液置于微量管中，加入1.5μl 10×核酸外切酶I反应缓冲溶液，该缓冲溶液为67mM Glycine-KOH，6.7mM MgCL2，10mM 2-巯基乙醇pH9.5；再加入5μl包含待测小分子的样品溶液，混合均匀后加入一定浓度的小分子的结合蛋白或(鼠源)单克隆抗体溶液3μl，该单克隆抗体溶液终当量浓度为加入的有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链的储备液浓度的5倍；在37℃恒温反应0.5小时；再加入0.5μl核酸外切酶I，置于37℃反应5分钟后，升温至80℃反应20分钟进行热灭活以终止酶反应，得末端保护反应的产物。

注意，以上反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变最优结果。改变比例或试剂加入顺序可使有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链的保护效率在5％～100％内变化。

本发明中，所述末端保护的寡核苷酸DNA单链的定量检测可采用现有的各种核酸定量分析技术进行，如印迹法、夹心式杂交酶标检测、基因芯片或定量聚合酶链反应(PCR)法进行检测。以下为采用定量聚合酶链反应(PCR)法对末端保护的寡核苷酸DNA单链实施定量检测的步骤：

a.根据定量聚合酶链反应法检测的标准程序，针对寡核苷酸DNA单链设计出前向引物与反向引物，即引物对；