[发明专利]人鼻咽组织特异性基因C10RF102编码蛋白的制备及其多抗、单抗的制备

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及人鼻咽组织特异性基因C1ORF102表达产物的获取及抗体制备，

背景技术

鼻咽癌是中国南方与东南亚地区常见的恶性肿瘤之一，该地区发病率居世界首位，严重威胁人民的生命安全。目前鼻咽癌的早期检测方法有多种，包括EB病毒血清学标记物、鼻咽癌相关肿瘤标记物如白细胞介素、肿瘤坏死因子、细胞间黏附分子以及端粒酶等的检测。虽然这些指标的单独或联合应用为鼻咽癌的诊断提供了有用的信息，但它们均缺乏足够的灵敏度和特异性。比如EB病毒不但与鼻咽癌的发生有关，而且与Burkitt淋巴瘤、上呼吸道的感染等密切相关，近来也有报导在各种T细胞淋巴瘤中检测到EB病毒DNA，而且并非所有鼻咽癌的发生均与EB病毒相关，90％以上的人群在成年前都感染过EBV，在NPC患者血清中检测到EBV也并不能证明EBV直接与NPC有关，鼻咽癌患者EB病毒抗体与病理诊断相比阳性符合率仅为72.6％～77.3％。因此，虽然EB病毒相关抗体滴度与鼻咽癌的发生发展有很高的相关性，其检测方法也有优越性，但仍然只能作为一种相关指标而起提示作用，不能用来作为鼻咽癌的确诊指标。而其他的一些鼻咽癌相关的肿瘤标记物如白细胞介素、肿瘤坏死因子、细胞间黏附分子以及端粒酶等，广泛表达于多种组织并且在不同肿瘤中都存在一定的表达差异，因此应用与鼻咽癌诊断也缺乏特异性。克隆与鼻咽癌发病密切相关的抑瘤基因是揭示鼻咽癌发病分子机制的必然途径，而且分子诊断灵敏度高，特异性强，取材一般不受组织或时相限制，因此将成为鼻咽癌早期诊断的新型手段，也将对鼻咽癌的防治产生重要的指导意义。我们发现的C1ORF102基因是一个人鼻咽-气管上皮组织特异性基因，在其他组织中没有表达，且在鼻咽癌中表达明显下调，因此，C1ORF102蛋白是一个鼻咽癌特异性的肿瘤标记物，检测C1ORF102蛋白用于鼻咽癌的诊断具有准确性和特异性高的优势。组织特异性基因是重要的功能基因，是特定组织维持其正常结构和功能不可缺少的基因；另外，组织特异性基因在相应组织病理生理过程中往往扮演极其关键的角色，并且被认为是组织特异性的诊断和药物治疗靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人鼻咽组织特异性基因C1ORF102编码蛋白的制备方法及其单抗和多抗的制备方法。

本发明的目的是通过以下方式实现的。

人鼻咽组织特异性基因C1ORF102编码蛋白的制备方法的具体步骤为：

根据C1ORF102基因参考序列设计特异性引物，C1ORF102-forward：5’-ATACATATGTCGGTGCGCACGTTACCG-3’，C1ORF102-reverse：5’-CTCGAGCTATAACTCATCCATCAT-3’，以人胎脑cDNA文库质粒为模板，PCR扩增出C1ORF102基因编码区；用Nde I和Xho I酶切PCR扩增出的C1ORF102基因编码区和pET28b载体，再将回收的5.3kb长的pET28b载体片段和C1ORF102基因编码区连接，构建成含融合基因的pET28b-C1ORF102载体，将含融合基因的pET28b-C1ORF102载体转入大肠杆菌RosettaBlue(DE3)中，经抗生素筛选、诱导表达、破碎分离纯化即得人鼻咽组织特异性基因C1ORF102编码蛋白。

所述的引物序列5’端带Nde I酶切位点，3’端引物带Xho I酶切位点。

所述的抗生素筛选过程为：将所述的pET28b-C1ORF102重组质粒转化的大肠杆菌，接种于含有200ug/ml卡那霉素的细菌培养皿上，37℃培养14-20小时，沾取单个菌落接种入3ml含有200ug/ml卡那霉素、34μg/ml氯霉素和12.5μg/ml四环素的LB培养液中，37℃过夜培养；将1ml过夜培养物接种至100ml含有200ug/ml卡那霉素、34μg/ml氯霉素和12.5μg/ml四环素的LB培养液中，于37℃培养3小时至OD₆₀₀为0.6，得OD₆₀₀为0.6的菌液。

所述的诱导表达过程为：将经过抗生素筛选的OD₆₀₀为0.6的菌液加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃培养5小时，得诱导表达的培养物。