[发明专利]一种用于检测对虾白斑综合症病毒的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，具体涉及一种利用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术检测对虾白斑综合症病毒的试剂盒及其检测方法。

背景技术

对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)是迄今为止危害最为严重的 一种对虾病毒，能导致养殖对虾大规模的暴发性死亡；其感染的宿主范围非常广，包括凡纳 滨对虾、斑节对虾、中国对虾、日本对虾以及长毛对虾等多种养殖品种，给养虾业造成了巨 大的经济损失。由于其强烈的传染性和极高的致死率，使得人们在应对它时，必须侧重于早 期的防控；国际兽医局(OIE)、联合国粮农组织(FAO)及亚太地区水产养殖发展网络中心 (NACA)规定需要报告的重要水生动物疾病病原之一。虽然目前已对WSSV的病原学、分子 生物学以及致病机理开展了深入研究，但是对其所引起疾病尚无有效的治疗方法，只能以预 防为主，而这又主要依赖于早期快速的诊断和筛查。

目前对于WSSV的检测方法主要包括临床组织病理学方法、电子显微观察技术、生物指 示法、酶联免疫吸附等免疫学方法以及应用PCR技术等分子生物学方法。但是现有的这些方 法都存在一定的不足，有些对技术条件要求高、检测时间长；有些所需要的材料制备麻烦， 费用高；有些灵敏度不高、特异性不强；PCR技术虽然敏感、准确、快速，但由于需要昂贵 的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及 基层普及应用。

LAMP是一种新型的核酸等温扩增技术。该技术针对靶基因的6个区域设计4条特异引物， 利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件下即可完成核酸扩增反应， 扩增出LAMP特征性梯状条带。LAMP技术在保持PCR技术优点的基础上，进一步增强了反 应的特异性和缩短了检测时间；特别是它不需使用昂贵的热循环仪，在等温条件下就能完成 反应，且扩增产物用肉眼能观察，可用于病原微生物的现场快速检测。但是在实际应用中， 由于特异性引物设计和其检测试剂盒研制的复杂性，导致LAMP技术还未能推广于医疗卫生、 食品等领域。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测WSSV的试剂盒。该试剂盒 特异性强，敏感性高，准确快速。

本发明另一目的在于提供一种利用上述试剂盒检测WSSV的方法。该方法方便灵敏快速， 增强了反应的特异性。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明用于检测WSSV的试剂盒包括如下组分：

(1)组织样品的基因组DNA提取液；

(2)LAMP预反应液；

(3)BstDNA聚合酶；

(4)LAMP反应稳定液；

(5)LAMP反应显色液；

(6)阳性对照DNA

(7)阴性对照DNA。

其中，所述组分(1)包括组织裂解液和DNA吸附液；组织裂解液为含有4～6M异硫 氰酸胍(GTC)、20～25mM柠檬酸钠、0.5％十二烷基肌氨酸钠和0.1～0.2Mβ-巯基乙醇；DNA 吸附液为含50％磁珠的悬浮液。

所述组分(2)包括20～25mM pH为8.8的Tris-HCl、2～4mM硫酸镁、10～12mM氯化钾、 10～12mM硫酸铵、1～1.25％TritonX-100、400～500μM dNTP、0.8～1.2M甜菜碱、0.8～1μM序 列如SEQ ID NO.1所示的引物WSSV-FIP、0.8～1μM序列如SEQ ID NO.2所示的引物 WSSV-BIP、0.2～0.4μM序列如SEQ ID NO.3所示的引物WSSV-F3、0.2～0.4μM序列如SEQ ID NO.4所示的引物WSSV-B3。

所述组分(3)为每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶。

所述组分(4)由矿物油或液体石蜡油组成。

所述组分(5)为含有10％SYBR Green I的荧光染料。

所述组分(6)为含有提取的WSSV病毒基因组DNA。

所述组分(7)为含有提取的健康对虾基因组DNA。