[发明专利]一种细胞培养用大孔微载体及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于大规模培养动物细胞的大孔微载体及制备方法和用 途，具体涉及一种以丝素蛋白为主要原料制备而成的丝素/壳聚糖大孔微载体 及制备方法和用途。

背景技术

微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技 术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。大孔微载体将细胞固定 在孔内生长，能最大限度地扩大比表面积，与其他方法相比，它的比表面积 更大，是实心微载体的几倍甚至几十倍；细胞在孔内生长，受到保护，剪切 损伤小；细胞三维生长，细胞密度将进一步提高，细胞密度是实心微载体 的10倍以上，有的可达10⁸个/ml；大孔微载体除了利于细胞高密度放大培养 外，在外源蛋白的长期高表达方面也具有明显的优势，适合于蛋白质生产和 产物分泌；另外，大孔微载体与种子细胞共培养，形成的复合体可看作许多 的微组织，这为体外组织构建提供了新的思路。

大孔微载体培养是高密度悬浮培养肝细胞的理想方法之一，许多研究机 构都在研究性能价格比较高的微载体。然而现有的微载体不能长期维持细胞 生长，细胞易受机械损伤，放大培养时细胞容易脱落且贴壁不均匀，为此有 必要提供一种新型微载体以克服现有技术中存在的缺陷。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种大孔微载体，其以生物相容性良好的丝 素蛋白、壳聚糖为原料，从而制备出一种既具有细胞亲和性，有助于细胞黏 附，支持大量细胞生长，又能长期维持细胞活性和细胞功能且成本低廉的能 够用于大规模培养细胞的大孔微载体。

本发明的另一目的在于提供上述大孔微载体的制备方法，该方法操作简 单，原料成本低，可被广泛使用。

本发明的又一目的在于提供上述大孔微载体在大规模动物细胞培养中的 应用。

为实现上述目的，本发明提供一种大孔微载体，该大孔微载体呈球形， 直径为200-500μm，孔径为40-80μm，其是由丝素蛋白和壳聚糖在交联剂的 作用下制得的。

在本发明的实施方式中，可通过下述方法制备所述大孔微载体，该方法 包括：

(a)将丝素蛋白溶液与壳聚糖醋酸溶液按比例混合，使得产生终浓度为 4-10w/v％的丝素-壳聚糖混合溶液；

(b)将所述丝素-壳聚糖混合溶液加入含乳化剂的油相中，得到白色乳 液；并向该白色乳液中缓慢加入交联剂，充分搅拌使水相交联固化；

(c)将步骤(b)中的白色乳液加入搅拌状态的pH为9-10的极性溶剂 中，并继续搅拌30-60分钟，过滤得到互不粘连的微球；

(d)固化所述微球并除去表面的油相，筛滤得到200-500μm的微球；

(e)除去微球中的残留的交联剂，并冷冻干燥，得到所述大孔微载体。

在优选的实施方式中，步骤(b)中加入的交联剂的量为每克干重的微载 体加入1-2ml的2.5％戊二醛溶液。

优选地，所述乳化剂为司班80，油相为液体石蜡；其中司班80、液体石 蜡的体积比为3∶100至5∶100。所述交联剂优选为戊二醛。所述极性溶剂选自 异丙醇、丙酮和乙醇等。

在优选的实施方式中，步骤(c)中所述搅拌为250-400转/分的恒速搅拌。

优选地，在步骤(d)中，通过用所述极性溶剂、石油醚和水洗涤来除去 所述油相。

优选地，在步骤(e)中，通过将微球在甘氨酸溶液中浸泡2-4个小时而 除去残留的交联剂。

在本发明的另一个实施方式中，在所述步骤(e)之后还包括消毒步骤。 所述消毒步骤为以钴60-γ射线辐照，或者是在将大孔微载体以蒸馏水或PBS 溶液溶胀后高温灭菌。

本发明提供的丝素/壳聚糖大孔微载体以丝素作为主要成分，因为丝素蛋 白具备良好的生物相容性和降解缓慢的特性，以及在湿态下有着优良的力学 性能，所以可以较长时间维持微载体的结构，既可支持大量细胞生长，又能 长期维持细胞活性和功能，在动物细胞长时间高密度培养中有独特的作用。

附图说明

图1-图2显示了本发明的丝素/壳聚糖大孔微载体的扫描电镜图片；

图3、图4分别显示本发明的丝素/壳聚糖大孔微载体与肝细胞CL-1在微 重力旋转培养体系中共培养的第3天和第7天取样的细胞在倒置显微镜下观 察到的肝细胞在材料上的黏附情况；