[发明专利]应用基因工程技术延长香蕉保鲜期的方法、组成物及其应用

说明书

技术领域

本发明是关于应用基因工程技术以延长香蕉保鲜期的方法、组成物及其应用，特别是指 通过基因转殖方法将干扰性RNA转殖于香蕉内以抑制/降低香蕉ACC氧化酶基因的mRNA 表达，进而抑制/降低乙烯的生物合成的方法、组成物及其应用。

背景技术

“后熟作用”意指更年性果蔬采摘后自行完成熟化的过程。为了运输或贮藏，有些更年性 果蔬需要提前采摘。其目的是，通过更年性果蔬自身的后熟作用，可以延长运、贮期。亦可 根据需要采取适当措施(如低温、气调、乙烯吸收剂、乙烯抑制剂等)以抑制/延缓更年性果 蔬的后熟过程，达到长期贮藏的目的。若需要提早上市，利用乙烯剂等可促进果蔬后熟。有 些果实如香蕉(Musa spp.)，必须经后熟阶段才能更好食用。

香蕉(Musa spp.)属于芭蕉科(Musaceae)芭蕉属(Musa)的单子叶植物，果实芬芳可口且营养 价值高，为世界重要经济作物之一。香蕉(Musa spp.)属更年性水果，经采收后，绿熟香蕉通 过后熟过程，产生更年性变化，包含内生乙烯的生成、淀粉及原果胶的水解等，待果肉软化、 甜度增加、香气产生后，食用价值始能提高。

现有技术中将香蕉提前采收，通过香蕉自身的后熟作用，可以延长其运、贮期。然而， 香蕉在运输过程中常仍因乙烯生成而造成果实后熟、甚者，过熟、败坏。因此，降低香蕉的 市场价值及影响香蕉的普及性。因此，通过对乙烯生物合成的控制，以提供解决香蕉后熟等 相关问题的方法。

乙烯(Ethylene)为气体形式存在的荷尔蒙，影响许多植物生理生化反应(Burg and Burg， 1962)。乙烯对植物的生长发育及逆境反应十分重要，例如当植物受到淹水、机械性伤害、病 菌感染、叶与花的老化及果实后熟，均会产生乙烯。乙烯的生物合成路径为甲硫胺酸 (methionine)通过S-腺甘甲硫胺酸合成酶(AdoMet synthetase)转化为S-腺甘甲硫胺酸 (S-Adenosyl-methionine，AdoMet)，再由ACC合成酶(ACC synthase，ACS)生成1-胺基环丙烷 -1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC)，ACC氧化酶(ACC oxidase，ACO)则氧 化ACC生成乙烯(Ethylene)(Yang and Hoffman，1984)。由此可知，ACO为乙烯生物合成路径 的最后酶，因此，可通过抑制ACO基因或蛋白质的表达以抑制/降低乙烯的生物合成，进而 达到延缓果实后熟的目的。本发明是以香蕉(Musa spp.)的ACC氧化酶基因： Mh-ACO1A(MAO1A，GenBank accession no.AF030411，SEQ ID No：14)、Mh-ACO1B(MAO1B， GenBank accession no.AF030410，SEQ ID No：15)及Mh-ACO2(MAO2，GenBank accession no. U86045，SEQ ID No：16)为目标基因，期望通过抑制这些基因的表达，以抑制/降低乙烯的生 物合成，达到延缓果实成熟的目的。

过去用以降低目标基因表达的方法，主要是以转殖目标基因的反义链(antisense strand)于 植物中，所产生的mRNA与内生性(endogenous)顺义基因的mRNA序列互补(complementary)， 形成双链(duplex)的结构，进而降解或干扰蛋白质转译的进行，达到抑制内生性基因表达的目 的；或构建带有大量表达(over-expressed)启动子的目标基因顺义链的方式，使基因大量表达 而造成共同抑制(co-suppression)现象，进而抑制基因的表达。然而，上述两种方法沉默(silience) 基因的效果并不好。随着基因沉默机制逐渐被明了，认为双链RNA才是造成基因沉默的主要 因子，因此构建能形成双链RNA的DNA结构，并转殖进入生物中，发现能提高沉默基因的 能力，其中若以功能完整的内含子(intron)为形成圈环(loop)的spacer，基因表达甚至几乎可被 完全抑制(Smith et al.，2000)。