[发明专利]贝类GⅠ型扎幌样病毒检测用的引物、探针、检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体涉及贝类GI型扎幌样病毒的检 测。

背景技术

扎幌样病毒(Sapporo-like viruses，SLVs)属于杯状病毒科，是引 起人类非菌性急性胃肠炎爆发和流行的重要因素之一，在很多国家均 有其爆发流行的相关报道，如日本、越南、泰国、美国和英国等，在 我国腹泻人群中也检测出GI和GII两种亚型的扎幌样病毒。目前 SLVs还不能进行组织培养，也未能建立合适的动物模型，它的基因 序列多变，样本中的病毒含量较低，不易被检测。扎幌样病毒可通过 粪口途径在家庭、医院、学校中爆发流行，也可通过人与人接触进行 传播。患者感染后，出现腹泻、呕吐和疼痛等症状。生食贝类等水产 品是引起扎幌样病毒感染的主要途径之一，因此如果对贝类等水产品 进行检测，并对感染的食品源头加以控制，对于保障人民健康有重要 意义。

发明内容

本发明的目的在于提供贝类GI型扎幌样病毒检测用的引物、探 针和试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种贝类GI型扎幌样病毒的检测方 法。

本发明目的通过如下方案予以实现：通过分析已报道扎幌样病毒 RNA多聚酶与衣壳蛋白的连接区域，分别设计引物和探针序列用于 实时荧光定量PCR。上游引物核苷酸序列(SLVs-FP)如SEQ ID NO：1 所示，下游引物核苷酸序列(SLVs-RP)如SEQ ID NO：2所示(通用 核苷酸符号：y＝c or t；s＝c or g；r＝a or g；h＝a，c or t；v＝a，c or g)； 与该引物配合使用的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，且该 探针5’端标记有报告基团(如FAM、VIC等)，3’端标记有荧光淬灭 基团(如TAMRA等)。以样本总RNA为模板，在50μL反应体系包 括：5×荧光定量PCR缓冲液10μL，1μL dNTPs(20ummol/L)，1.5μL 引物SLVs-RP(10ummol/L)，1.5μL引物SLVs-FP(10ummol/L)，1μL 荧光探针(10ummol/L)，50ng总RNA(3μL)，1μL Taq酶(3U)， 用DEPC处理水补充到50μL，进行实时荧光定量PCR扩增，反应条 件是：93℃，3min；93℃，30s；53℃，40s共做40个循环。当探针 完整的时候，5’端报告基因所发射的荧光能量被3’端淬灭基团吸收， 仪器检测不到荧光信号。随着实时荧光定量PCR的进行，Taq酶在链 延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’→3’外切核酸酶活性就会 将探针切断，报告基因远离淬灭基团，其能量不能被吸收故发出的荧 光信号被仪器检测到，每个循环接收采集数据，故每经过一个PCR 循环，荧光信号随着目的片段的延伸有一个同步指数增长的过程，反 应结束后根据扩增曲线判定结果，从而实现对GI型扎幌样病毒的检 测和定量。也可用含有本发明引物和探针的试剂盒通过实时荧光定量 PCR检测贝类GI型扎幌样病毒。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明引物和探针特异 性好，制备成试剂盒用于贝类GI型扎幌样病毒的检测灵敏度、准确 性高；本发明检测方法可以快速直观判断样品是否含有GI型扎幌样 病毒，并能准确测定样品中GI型扎幌样病毒的拷贝数含量。

附图说明

图1为实施例3中实时荧光定量PCR检测GI型扎幌样病毒的标 准曲线；

图2为实施例4中实时荧光定量PCR检测GI型扎幌样病毒的结 果，其中，1为贝类中GI型扎幌样病毒的实时荧光定量PCR扩增结 果，2为干净贝类中GI型扎幌样病毒的实时荧光定量PCR扩增结果， 3为贝类中诺瓦克样病毒阳性质粒的实时荧光定量PCR扩增结果；

图3为实施例5中实时荧光定量PCR检测GI型扎幌样病毒的灵 敏度实验，其中，1表示贝类中GI型扎幌样病毒的量为10⁶拷贝/μL， 2表示贝类中GI型扎幌样病毒的量为10⁵拷贝/μL，3表示贝类中GI 型扎幌样病毒的量为10⁴拷贝/μL，4表示贝类中GI型扎幌样病毒的 量为10³拷贝/μL，5表示贝类中GI型扎幌样病毒的量为10²拷贝/μL， 6表示贝类中GI型扎幌样病毒的量为10拷贝/μL，7为阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，但具体实施例并 不对本发明做任何限定。