[发明专利]一种用于防治肝硬化的人源细胞珠蛋白及其制备方法

权利要求书

1、一种人源细胞珠蛋白的表达质粒，该质粒是将SEQ NO.1所示的DNA片段用NcoI和HindIII酶切后克隆到载体pET-32a的表达区得到。

2、权利要求1所述的一种人源细胞珠蛋白的表达质粒的制备方法，该方法由以下步骤组成：

(1)提取Hep G2细胞的总RNA，用引物1和引物2进行反转录PCR得到序列为SEQ NO.2的DNA片段；

(2)以序列为SEQ NO.2的DNA片段为模板用引物2和引物4进行PCR反应得到序列为SEQ NO.3的DNA片段；

(3)以序列为SEQ NO.3的DNA片段为模板用引物3和4进行PCR反应得到序列为SEQNO.1的DNA片段；

(4)序列为SEQ NO.1的DNA片段用NcoI和HindIII酶切后克隆到载体pET-32a的表达区，得到重组质粒pET-32a-hCygb；

所述引物1的序列为5’-CTGGTATTGAGGGTCGCATGGAGAAAGTGCCA-3’；

所述引物2的序列为5’-TCATCATCATCATTCTTCTGGTATTGAGGGTCGCA-3’；

所述引物3的序列为5’-GATGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTC-3’；

所述引物4的序列为5’-GCACTCGCTAAGCTTCTACGGCCCCGAAAGGG-3’。

3、一种转化体，其特征在于该转化体的宿主为大肠杆菌BL21(DE3)，导入的重组载体为权利要求1所述的人源细胞珠蛋白的表达质粒。

4、一种重组人源细胞珠蛋白，该蛋白由权利要求3所述的转化体在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导培养下的表达产物经凝血因子FXa切割去除Trx标签、His标签和FXa识别序列后获得，其中所述的表达产物是由Trx标签、His标签、FXa识别序列和人源细胞珠蛋白依次连接构成的融合蛋白。

5、权利要求4所述的一种重组人源细胞珠蛋白的制备方法，该方法由以下步骤组成：

(1)将权利要求3所述转化体在含异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB培养基中诱导培养；

(2)收集菌体，将菌体破碎，取上清，用组氨酸标记亲和层析柱分离出融合蛋白；

(3)所得融合蛋白用凝血因子FXa酶切，然后上组氨酸标记亲和层析柱，用氯化钠溶液按1～99％(w/v)的梯度洗脱，收集出现第一个洗脱峰的洗脱液，最后用pH值为8.0、浓度为10mM的Tris-HCl缓冲液透析，浓缩即可。