[发明专利]J亚群禽白血病病毒基因检测用引物组、检测方法和快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及J亚群禽白血病病毒基因的生物学鉴定，具体涉及一种J亚群禽白血病病毒基因检测用引物组、检测方法和快速检测试剂盒。 

背景技术

目前对于禽白血病国内外尚未有效的疫苗和药物进行防制，控制该病的主要手段是通过对鸡群定期进行禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)检测，及时淘汰带毒阳性鸡，通过频度检测来净化和清除鸡群中的ALV。 

根据病毒在不同遗传型鸡胚成纤维细胞上的宿主范围、不同病毒间的干扰情况及病毒囊膜中和抗原特性，可将ALV分成A、B、C、D、E和J亚群6亚群。A亚群和B亚群病毒为临床上常见的外源性病毒，E亚群为极普遍的非致瘤性内源性病毒，而C、D亚群病毒在临床上相对罕见，外源性J亚群禽白血病病毒(ALV-J)则是最新被鉴定的新亚群。在各种外源性ALV亚群中，目前以ALV-J亚群对我国养禽业的危害性最大，并出现了髓细胞瘤型和血管瘤型等多种病理表现型，在临床表现上还容易与网状内皮细胞增殖综合征、马立克氏病等肿瘤性疾病相混淆。 

目前，国内外对于ALV-J的检测方法主要有ELISA、间接免疫荧光试验、常规PCR等，其中以ELISA法在临床上应用最广，其主要原因是该法操作相对简便，有商品化的检测试剂盒可以利用，国内外一些大型种禽场多采用该方法进行种禽群的检测和净化。 

但是目前的ELISA检测试剂盒检测对象是ALV的群特异性抗原，由于内源性ALV群特异性抗原的存在，故ELISA检测有一定的假阳性。ELISA检测的另一个不足之处在于目前国内使用的禽白血病检测试剂盒均是国外进口，其价格非常昂贵。 

ALV-J常规PCR和间接免疫荧光试验也已经建立，但其操作复杂，对设备仪器有专门的要求，适于在实验室条件下使用，而难以在基层推广利用。鉴于我国养禽业正面临较大的禽白血病威胁，需要建立一种快速、简便的ALV-J检测方法，以推动和促进我国养禽业对J亚群禽白血病的净化与防控。 

等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性，LAMP主要是利用4种不同的特异性引物(引物F3、引物B3、引物FIP和引物BIP)识别靶基因的6个特定区段，在聚合酶和等温条件下高效、快速、特异地扩增靶序列，扩增反应结束后，通常是采用染色剂对反应产物进行分析。LAMP中所用到的聚合酶通常都选用具有链置换特性的DNA聚合酶，如Bst DNA聚合酶。对LAMP来说，4种特异性引物的设计是其关键所在。 

LAMP因其自身的优点，现已被用于病原微生物的检测和传染性疾病的诊断，如：严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、新城疫病毒(NDV)、I型艾滋病病毒(HIV-1)的检测、分支杆菌属检测、腺病毒性结膜炎检测、真菌检测等，现尚未见有LAMP用于ALV-J基因检测的相关报道。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可用于环介导等温扩增 技术检测J亚群禽白血病病毒基因的引物组。 

本发明的另一个目的在于提供用上述引物组快速、高效、特异性检测禽白血病病毒J亚群基因的检测方法。 

本发明的另一个目的在于提供根据上述检测方法制备的快速检测试剂盒。 

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的： 

一、本发明的J亚群禽白血病病毒基因检测用引物组，是基于环介导等温扩增技术，根据已公开的J亚群禽白血病病毒基因序列，选取J亚群禽白血病病毒基因的特异性序列，然后分析设计出的，能专一性鉴别J亚群禽白血病病毒基因的特异性引物组，通过LAMP来鉴定J亚群禽白血病病毒基因，该引物组由如下四条引物组成： 

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示； 

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示； 

内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示； 

内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示； 

其中，R为G或A，Y为T或C。 

二、本发明的快速检测方法，是采用上述引物组，对待测样品DNA进行环介导等温扩增反应，反应后进行琼脂糖凝胶电泳，阳性反应显示梯状带，或向反应产物加显色剂，根据颜色变化判断反应结果。