[发明专利]腺相关病毒载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种具有抑制乙型肝炎病毒复制能力和肝癌细胞生长和转移的腺相关病毒载体及其构建方法和应用。 

背景技术

乙型病毒性肝炎是我国最主要的传染病，据统计目前乙肝病毒携带者约1.5亿，占全国总人口的百分之十以上。大量临床和亚临床乙肝患者的存在，不仅严重损害了人民群众的身体健康，造成巨大的社会劳动力丧失及社会健康成本增加。同时，许多资料证实，乙肝病毒也是引起原发性肝细胞癌的主要原因之一。而肝细胞癌是预后最差的恶性肿癌之一，目前无有效的治疗方法，五年生存率低于5％。 

乙肝疫苗的应用，对未感染乙肝病毒的人群起到了有效的保护作用，但对感染者无治疗作用。目前对乙肝患者仅有的治疗手段为a干扰素和类核苷物，“Lamivudine”和“Adefovir dipivoxil”，但临床效果仍不理想。 

siRNA现象为近年生物学上一革命性的发现，它通过特异性地与靶基因结合，选择性抑制靶基因表达，从而干扰靶基因的功能。目前的研究证实，siRNA技术可以应用到许多病毒性疾病，如HBV、HCV，HIV等，干扰相关病毒的复制，以及肿瘤性疾病，如肝癌、鼻咽癌、肺癌等，或选择性杀伤肿瘤细胞，增强机体的免疫能力，达到治疗病毒性疾病或肿瘤的目的。 

乙型肝炎病毒为双链DNA病毒，其基因物质相对于突变频繁的HIV等病毒，十分保守，突变少。乙型肝炎病毒少突变的生物学特性特别适合siRNA治疗。各国实验室对乙肝病毒进行了大量的体外及动物体内siRNA抑制有效性研究，是利用siRNA干扰技术进行人体临床试验准备最充足的一个病毒。 

由于siRNA干扰在动物体内实验的结果令人十分鼓舞，加之目前对病毒性 疾病、肿瘤性疾病缺乏有效的治疗措施，siRNA干扰技术被广泛应用于病毒性疾病及恶性肿瘤的治疗方面，因此，仅在美国就有115家商业性公司从事siRNA方面的研究(www.researchandmarkets.com)，在众多公司中，Sirna、RNAiTechnologies、OligoEngine、Ambion和Stratagen为其中的佼佼者。 

干扰素(interferon)的发现和研究已有五十多年的历史。干扰素为脊椎动物在外源性抗原的刺激下免疫系统所产生的一组糖蛋白。不同亚型干扰素对外源性抗原如病毒、病菌，内源性的肿瘤细胞有着不同程度的非特异性的杀伤和抑制作用，已被应用于临床，并被证实是有效的。 

近年来，随着高效干扰素(RECOMBINANT SUPER COMPOUNDINTERFERON，rSIFN-co)的发现和其对病毒、肿瘤细胞的高效杀伤作用，引起医学界对干扰素抗病毒和抗肿瘤的再认识。 

高效干扰素是根据不同类型干扰素氨基酸顺序的保守性，人工产生的一种新的干扰素，有别于普通干扰素，可产生超强的抗病毒及抗肿瘤作用。目前在国内外都有高效干扰素进入临床试验阶段。但都为利用基因工程技术在大肠杆菌等原核细胞中表达、进而纯化的干扰素。 

腺相关病毒(AAV)载体是目前唯一一个被美国食品和药物管理局(FDA)批准可以用于临床基因治疗的载体，AAV载体最大的特点是：不致病，十分安全；根据血清型的不同，可选择性感染不同类型的组织或细胞；可以较长时间稳定表达所携带的基因；通常情况下重组的AAV以核外染色体形式存在，野生型AAV的整合部位也很清楚，不会诱发被感染的细胞癌变。但是，AAV载体的生产和纯化技术复杂，要求很高的技术和经验，较难推广。 

因此，需要发明一种新的腺相关病毒载体以解决上述问题。 

发明内容

本发明的目的是提供一种腺相关病毒载体，充分结合shRNA、a干扰素和腺相关病毒载体三方面的优势，能够抑制乙型肝炎病毒的复制能力和肝癌细胞生长和转移。 

本发明还提供了一种腺相关病毒载体的制备方法和应用。 

本发明提供了一种腺相关病毒载体，包括编码针对乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的编码基因shRNA和人工a干扰素编码基因。 

作为本发明腺相关病毒载体的优选实施方式，所述的腺相关病毒的载体非选择性或选择性在肝组织或肝癌细胞中表达。 

作为本发明腺相关病毒载体的优选实施方式，所述的腺相关病毒的载体包括各种血清型，特别是1型、2型、8型及嵌合型。