[发明专利]一种人3号染色体计数探针的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种人3号染色体计数探针的制备方法，还涉及利用人3号染色体计数探针制备一种人3号染色体计数试剂盒，应用本发明的人3号染色体计数探针及相应的试剂盒可以对人3号染色体进行准确、快速的计数。

背景技术

人3号染色体是目前已知的最大的人类染色体之一，占整个人类基因组的十五分之一，共有1.99亿个核苷酸。这个染色体片段具有许多重要的特征：只有4个重叠群，其中之一是目前已完成测序的生物基因组中最长的连续核苷酸序列；它是目前已知基因组大片段扩增发生率最低的染色体；3号染色体在单个染色体水平发现的蛋白质编码基因最多，已发现近1600个蛋白质编码基因，其中包括许多重要的chemokine受体基因(chemokine receptor gene)簇，复合人类癌症基因，比如FHIT。有研究表明，在膀胱癌、激素分泌型和无功能型腺瘤[FanX，Paetau A，Aalto Y.Gain of chromosome 3 and loss of 13q are frequent alterations in pituitaryadenomas.Cancer Genet Cytogenet.2001 Jul 15；128(2)：97-103.]、B细胞淋巴瘤[K.F.Wong，C.C.So，J.C.W.Chan.Gain of chromosome 3/3q in B-cell chronic lymphoproliferative disorder isassociated with plasmacytoid differentiation with or without IgM overproduction.Cancer Geneticsand Cytogenetics，136(1)，2002 July 1：82-85]中经常出现三体或多倍体情况，此外，3号染色体缺失的黑素瘤病人无病生存期短[Emine Kilic，Nicole C.Naus，Walter van Gils，etc.ConcurrentLoss of chromosome arm 1p and chromosome 3 predicts a decreased disease-free survival in uvealmelanoma patients.investigative ophthalmology & visual science，july 2005，46(7)：2253-2257]。因此，研究该染色体数目畸变，对于研究新的诊断标志物或是癌症发展、预后等方面将有重要意义。

目前常用的染色体组型分析可以确定染色体的非整倍异常，但这需要进行细胞培养和制备高质量的中期染色体片，而这对于肿瘤细胞来说是极其困难和耗时的。为了解决这个技术难题，其中一个思路是筛选并制备相应的染色体计数探针，但目前染色体计数探针制备缺乏一个系统和成熟的方法。

本发明人在长期研究的基础上设计及筛选人3号染色体计数探针，并利用荧光原位杂交技术检测中期或间期细胞中3号染色体数目。它应用荧光物质标记的双链DNA核酸探针与染色体DNA互补序列杂交，在核中或染色体上显示DNA序列的位置。在此基础上本发明人还开发人3号染色体计数试剂盒，该试剂盒具有快速、无创性、敏感度高和特异性强等优点，无需进行细胞培养，就能够在中期和间期细胞中检测3号染色体的数量。

由于本发明提供了这种3号染色体计数探针的制备方法，并在此基础上自主研制开发3号染色体计数试剂盒，对摆脱对进口试剂的依赖，填补国内该检测领域的空白具有十分重大的意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种人3号染色体计数探针的制备方法。

根据本发明一个优选的实施方案人3号染色体计数探针的制备步骤包括：

(1)引物设计：人3号染色体着丝粒区域PCR扩增引物设计和验证。

(2)克隆质粒制备：配制PCR反应体系，以人基因组为模板进行PCR扩增，将纯化后的目的产物与载体pMD18-T连接，制备出包含目的片段的克隆质粒pMD18-T-C3。

(3)C3探针制备：可采用以下两种方法进行制备。

方法一：以包含目的片段的质粒pMD18-T-C3DNA为模板，进行PCR扩增，通过PCR反应将氨基修饰的dUTP掺入到目的产物中，然后经过PCR产物纯化、浓缩、定量；对纯化后的PCR产物进行荧光标记、纯化、计算标记效率、定量，而获得C3探针，避光、-20℃储存。