[发明专利]检测脆性X综合征的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测临床样品中脆性X综合征的试剂盒，特别是涉及以亚硫酸氢盐修饰-长片段聚合酶链反应技术筛查脆性X综合征的试剂盒。

背景技术

脆性X综合征(FraX)是一种常见的遗传性智力低下综合征，其发病率仅次于唐氏综合征，呈X连锁遗传，占X连锁智力低下的40％。发病率男性为1/4000，女性为1/6000。外显率也因性别不同有差异，男性80％，女性30％。脆性X综合征在表型方面具有两大特点：一是轻度到重度不等的智力低下，IQ值在20-60之间，伴有不同程度的体型异常；头大、方额、大耳朵、大下颌，大多数男性患者在青春期发育后出现大睾丸，并有明确的伴性遗传的智力低下家族史。二是行为障碍，多数男性患者性情孤僻、反应过度和精神失常。许多患者还出现轻度的结缔组织异常，如脊柱后侧凸、皮肤松弛、关节伸张过渡和二尖瓣脱垂等。当女性患者具有同样的表型异常时，根据正常基因所在染色体随机失活的程度而出现不等的外显率。

95％以上的FraX患者，其发病的分子遗传学基础是脆性X综合征智力低下基因1(FMR-1基因)(CGG)n结构扩展突变，5％以下则是由FMR1基因的错义突变和缺失型突变影响了FMR1基因的正常结构、功能所导致。

FMR-1基因位于Xq27.3，含17个外显子，全长38kb。在基因的5’非翻译区存在一段数目可变的(CGG)n重复序列，其上游250bp处存在一CpG岛。CpG岛及(CGG)n如发生甲基化，则FMR-1基因的转录受到抑制。正常人群FMR-1基因(CGG)n重复次数在6～50之间。前突变(CGG)n重复数在50～200之间且CpG岛无异常甲基化，此时FMR-1基因表达基本正常。(CGG)n重复数超过200时为全突变，常伴有CpG岛异常甲基化，使FMR-1mRNA的翻译受抑制，从而造成临床症状。

后续的研究发现前突变的个体可能会患有轻微的认识/行为缺陷，20％的女性携带者有卵巢功能早期衰退，40％的男性携带者在50岁后会有脆性X综合征相关的振颤共济失调症(FXTAS)。

携带前突变的男性能将突变基因传给女儿，在此传递过程中，CGG序列一般不会有大的扩增，不会导致全突变。但是，第三代患病风险则有40％，第四代患病风险已高达50％；而他们的兄弟姐妹患病风险率却较低(＜9％)，此现象称为Sherman现象。

全突变母亲每次妊娠有50％机会传递全突变给胎儿，后者若为男性则几乎都有智力低下及不育，若为女性则精神发育迟缓(MR)的机会约50％。若母亲为前突变携带者，则胎儿受累(扩展为全突变)机会与母亲CGG重复数大小有关。CGG重复序列越长，出生全突变患儿的可能性越大。当母亲的CGG重复数为50-59时，基本后代DNA的CGG不扩展；当母亲的CGG重复数为60-69时，后代有17％的几率产生扩展；当母亲的CGG重复数位90-113时，扩展几率为100％。。前突变和全突变者的亲属出生患儿的可能性也比正常人群高。

脆性X综合征的常规实验室诊断主要为染色体分析和分子遗传学诊断。染色体分析通过诱导X染色体产生脆性部位；但敏感性低，有全突变的男性约15％～50％的细胞有脆性部位，女性仅为0～30％。因此对发病男性的诊断较成功，但前突变的女性和传递致病基因的男性容易漏诊，因为有脆性部位的细胞百分比低，甚至一些女性和有全突变而表现较轻的男性也不被发现。分子遗传学诊断主要检测FMR1基因CGG重复扩展及甲基化状况。目前有两种方法：多聚酶链反应(PCR)和Southern印迹。PCR对正常范围的重复序列和较小重复序列的前突变有很高的敏感性，但不能扩增出全突变和较大重复序列的前突变，因此PCR对全突变只能进行间接诊断。一般情况下，当PCR在男性扩增出1个正常范围或前突变片段，在女性扩增出2个片段(正常范围，中间范围或前突变)，不再需要Southern印迹进一步证实。但有时复杂的细胞嵌合体患者PCR方法会产生假阴性。也有学者设计出甲基化敏感PCR来了解男性患者的FMR1基因甲基化情况。但因正常女性存在X染色体失活(甲基化)，该方法并不适用。Southern印迹可以检测出各种大小CGG重复扩展和甲基化情况，但分辨度低，方法复杂、费时而昂贵，不适于大规模筛查。