[发明专利]利用环介导等温扩增技术快速检测淋病奈瑟菌

说明书

技术领域

本发明属于生物医学诊断领域，具体涉及一种用于使用环介导等温扩增(LAMP)技术快速方便检测淋病奈瑟菌的方法。可用于临床诊断以及个人早期筛查等。

背景技术

淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)是常见的泌尿生殖系统传播疾病病原体。传统的临床检测方法是使用细菌培养法，但是该方法操作难度大，耗时长，标本运送条件极为严格，并且还存着检出率低的缺点，容易导致漏诊误诊。此外，该方法还需侵入式的获取样本，对患者造成较大痛苦。常规的PCR检测方法可以避免这一问题，并已有一些利用核酸扩增的方法检测淋病奈瑟菌的商业试剂盒，但是这些试剂盒都需要使用特定的专业仪器，需要在专业的实验室内完成检测。另外最重要的是常规聚合酶链式反应技术(PCR技术)难以完全回避假阳性的问题。这是由于PCR结束电泳需要人工开关PCR管并使用移液器吸取样品，进行琼脂糖凝胶电泳对结果进行判断。由于PCR产物的高浓度，开管闭管对其产物的处理对操作人员的要求极高，稍不小心则极为容易产物气凝胶的污染，导致假阳性结果的出现。此外，使用这一技术进行核酸扩增放大需要用到离心机，PCR仪，电泳仪，凝胶成像系统等一系列专业分子生物学仪器。这些仪器都非常昂贵，需要受过训练的专业人员来操作，不仅如此，对结果的检测确定还需要使用琼脂糖凝胶电泳，不仅耗时长，工序复杂难以实现大样本操作，而且需要操作人员有熟练的分子生物学操作技术，还需要操作人员长时间接触致癌物溴化乙锭等对健康有严重影响的有毒有害化学物质。

另一种后来发展的技术，荧光定量PCR技术，通过使用PCR反应的同时测定PCR管内荧光值的变化来对结果进行判读。由于不需要开管取出PCR产物进行电泳判断结果，可以在一定程度上避免PCR产物气凝胶交叉污染的假阳性问题。一些使用荧光定量PCR技术检测淋病的方法也被发展起来，如专利CN 100415900c公开了一种使用自身淬灭探针的荧光定量PCR技术来检测淋病的试剂盒。然而荧光定量PCR技术需要使用昂贵的荧光定量PCR仪(动辄几十万至上百万人民币)，这限制了这个技术的广泛使用，只有少数专业的实验室才能进行相应的检测。

淋病作为性病的一种，一般通过性途径传播但并不止限于性传播。可是中国传统文化的影响或者一些心理上的原因，一些患者或者怀疑患者不愿意或者不好意思上正规的医院进行检查，而倾向找一些地下的非正规游医进行诊断治疗。这些地下游医技术良莠不齐，而且通常情况下由于仪器设备条件限制，只能仅仅靠经验判断而不是使用现代分子生物学技术进行确诊，导致误诊率漏诊率高，不仅可能给患者造成不必要的巨大的精神压力的经济损失，而且可能由于漏诊造成疾病的更大范围传播，给公共卫生带来潜在的威胁。如果有一种快速的可以在正规药房购买的检测试剂盒或者检测方法，可以自己完成检测并提供科学的诊断治疗建议，无疑将会对公共卫生水平的提高带来很大帮助。

在2000年后，对于核酸扩增技术出现了一种和聚合酶链式反应技术截然不同的技术：环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。环介导等温扩增技术主要利用了Bst DNA聚合酶能将新生成的核酸单链从新合成的DNA双链上置换下来的机理，实现在一个恒定不变温度下对核酸进行扩增。关于这项技术的详细的反应机理以及其和聚合酶链式反应的不同可参见专利CN 100422323C(授权号)和CN 101173317A(公开号)。目前已有将这个技术应用于一些疾病的快速检测的学术文章报道，如艾滋病，登革热甚至猪病毒的检测等。但将其应用于淋病奈瑟菌的检测，国内外仍未见报道。

发明内容

在本发明中公开了一种利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)对淋病检测的方法。LMAP反应最主要的特点是等温链替换扩增。这使得一个简单廉价的小型恒温装置就可以完成反应。如小型金属浴装置，小型水浴装置或者小型烘箱。如果做成和lamp试剂盒配套的65度恒温超小型装置的话甚至可以以更为廉价的简单电路实现。环介导等温扩增技术需要对目标基因的六个位置设置4个引物或者6个引物，利用特定的具有链置换活性的耐热DNA聚合酶Bst酶在等温的条件下形成特殊结构从而使目标基因实现高效扩增，而根本不需要进行传统的的热循环。相比PCR技术，LAMP技术更适合于应用到有大量样品的，非实验室的检测场所。这种技术不仅几乎不需要专业仪器，操作上更为简单，对操作人员技术要求更低，而且反应时间仅需一小时左右。