[发明专利]一种无诱导高效蛋白表达体系及其构建方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种无诱导高效蛋白表达体系及其构建方法。

背景技术：

目前人们普遍使用PCR方法获得外源基因，首先在克隆载体上进行测序，证实无误后再亚克隆至表达载体，这增加了分子生物学操作步骤，也增加了基因转移过程中出错的几率，同时，在亚克隆时对外源基因5’端酶切位点的种类要求严格，它要求克隆载体和表达载体中外源基因上游存在共同的酶切位点。对酶切位点的限定大大影响了ATG与SD保守序列之间距离的选择。而二者之间的距离对基因表达水平有极大的影响。研究结果表明，SD保守序列与ATG之间以6-12个碱基为最佳，超出此范围会降低蛋白质的表达水平。

目前要在特定宿主细胞表达外源蛋白必须使用与之相适应表达体系。对于原核表达系统来说，原核表达体系中使用的启动子类型主要有基于lac操纵子的启动子、T7噬菌体启动子、λ噬菌体PL启动子、碱性磷酸酶phoA启动子等。含这些启动子的体系表达外源蛋白时都需要满足特定的诱导条件。诱导lac启动子需要cAMP激活蛋白，即CAP，而在含葡萄糖的培养环境中CAP含量很低，外源基因不能表达。也就是说含lac启动子载体必须在无葡萄糖培养时才能表达外源蛋白，而且还需要补加IPTG诱导。但是IPTG价格昂贵，不能用于大量诱导。用T7噬菌体启动子时，宿主菌细胞内必须能提供T7噬菌体基因1的产物，即T7噬菌体RNA聚合酶，要么由感染性入噬菌体提供，要么由插入目的宿主菌染色体的基因产生，一般采用的溶源性细菌BL21(DE3)，其中T7噬菌体基因1是受控于IPTG诱导的了lac UV5启动子。用λ噬菌体PL启动子时，其受控于温度敏感阻抑物cIts857，宿主菌必须携带cIts857基因，阻抑物cIts857在低温下启动表达，高温时不能。phoA启动子是碱性磷酸酶启动子，在过量磷酸盐存在时被抑制，磷酸盐饥饿时被逐渐诱导。

因此，目前没有任何一种表达体系可在无需诱导条件下进行外源基因的表达，更不用说能在不同宿主细菌中表达。

发明内容：

本发明提供了一种无需诱导，能在多种不同的宿主细菌中高效表达目的蛋白的表达体系及其构建方法，该表达体系克服现有技术的不足，实现了无需诱导的条件下进行外源基因的高效表达。

本发明所述的无诱导高效蛋白表达体系，包括NAD(P)H脱氢酶基因启动子和pMD 18-Tsimple克隆载体，在启动子序列的3’端接有SD序列，SD序列后接有目的基因，由此构建的片段插入pMD 18-T simple克隆载体的T克隆位点中，形成环状的表达质粒，所述的NAD(P)H脱氢酶基因启动子的序列如SEQ1所示，所述的SD序列如SEQ2所示。

本发明还可以在目的基因后面接有强终止密码子TGA。

本发明通过以下技术方案实施的：

(a)以希瓦氏菌S12基因组DNA为模板通过PCR方法扩增其NAD(P)H脱氢酶基因启动子；

(b)设计引物PCR扩增目的基因，在其5’端加入高效SD序列；

(c)设计引物桥，将步骤(a)得到的NAD(P)H脱氢酶基因启动子与步骤(b)得到的含有目的基因的片段连接，连接产物与pMD 18-T simple载体重组，使连接产物插入pMD 18-T simple载体的T克隆位点，形成环状的表达质粒，即为无诱导高效蛋白表达体系；

将步骤(c)得到的重组质粒转入受体菌中，表达目的蛋白。

本发明所述的目的基因可以是三苯基甲烷氧化酶基因TpmD，受体菌可以是E.coli DH5α，还可以是脱色希瓦氏菌S12。

本发明所述的目的基因可以是荧光蛋白EYFP基因，受体菌可以是E.coli S17-1。

本发明构建的无诱导高效表达体系，转化进入受体菌后，能在无需诱导的情况下，高效的表达目的蛋白。

利用本发明所构建的无诱导高效表达体系，是利用了在细菌中广泛发挥作用的NAD(P)H脱氢酶基因的启动子，所构建的体系表达目的蛋白无需昂贵的IPTG或者其他诱导物诱导，不受细菌种类的限制，只要转化进细菌细胞，即可发挥作用，高效表达目的蛋白，其表达量甚至超过原始基因在原始宿主的表达量，因而大大扩展了应用领域，本发明构建的表达体系是以pMD 18-T simple克隆载体为基础，因此具有操作容易，拷贝数高的特点，这大大简化了操作步骤，减少了基因出错的几率。由于未影响LacZ基因片段的α互补功能，蓝白筛选手段仍然适于对重组子的筛选大大简化了筛选目的转化子的工作，同时可利用载体的通用引物进行测序验证。利用这一表达体系构建方法不仅节约时间、减轻工作量，而且成功率、可靠性都比较高。