[发明专利]一种细菌厌氧呼吸过程细菌膜内外质子动力的测定方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及一种细菌厌氧呼吸过程细菌膜内外质子动力pmf的测定 方法，从而表征细菌厌氧呼吸产生的能量。

背景技术：

厌氧呼吸是一类在无氧或低氧条件下进行的，以氧气以外物质为呼吸链末端电子受体的 生物氧化过程，是一类产能效率较低的呼吸形式。厌氧呼吸的一般过程为：1)电子供体在特 异性酶的作用下被氧化脱下电子，电子沿电子传递链按电势由低到高传递，最后交给末端电 子受体；2)在电子传递过程中，偶联H⁺由细菌胞质向胞外运输，形成跨膜的H⁺浓度梯度， 把化学能转化为电势能；3)H⁺在电化学电势驱动下，通过菌体细胞膜上的F₀F₁-ATP酶分子 的特殊通道回流到细菌胞质，同时释放自由能偶联ATP的合成。

在细菌呼吸过程中，能量产生是核心的内容。在生理条件下合成一个ATP分子所需自由 能大约为+40～50kJ/mol，每合成一分子ATP大约需要2～3个H⁺跨膜。因此细菌由细菌胞质向 胞外运输的H⁺量就可以显示细菌能产生ATP的量。虽然体外测定ATP的方法有很多，但是对于 完整的细胞来说，直接测定其产生的ATP仍然比较困难。能量的产生依赖于细菌膜内外质子 动力pmf(proton-motive force)的存在，pmf产生是细菌呼吸产能的基础和前提，是细菌呼吸 产能的一种表征，可以通过测定pmf来反映细菌呼吸产生的能量。

然而细菌厌氧呼吸是一类产能效率较低的呼吸形式，其呼吸过程中细胞膜内外的pmf差较 微弱。如何准确测定细菌厌氧呼吸过程中细胞膜内外pmf是细菌厌氧呼吸产能研究中的技术难 点。

对于细菌呼吸过程中质子动力的测定技术，在国际上基本有两种方法。一种是丫啶橙显 色双波长分光光度法测定pmf。这种方法的基本原理是根据丫啶橙在不同pH条件下光吸收的 最大波长的不同来指示体系中pH的变化，从而达到测定pmf的目的。一般采用的A₄₉₃和A₅₃₀的 差值变化来表征在细菌呼吸过程的pmf的变化。这种方法对于那些在493nm或530nm有光吸收 的电子受体物质则不适用。另一种方法是采用电极测试法直接测定pmf。上述两种方法测定的 都是pmf的脉冲变化，即整个呼吸过程中H+被泵出细胞膜及回流的瞬时变化，不能准确表征 能量的产生。

发明内容：

本发明的目的是提供一种快速、准确、适用范围广的测定细菌厌氧呼吸过程中细菌膜内 外质子动力pmf的方法，从而表征细菌厌氧呼吸产生的能量。

本发明所述的测定细菌厌氧呼吸过程细菌膜内外质子动力(pmf)的方法，主要利用脂溶 性的羧基试剂二环己基碳二亚胺DCCD与细胞膜上F₀F₁-ATP酶分子上的F₀蛋白亚基结合， 使H⁺无法回到细胞膜内，在厌氧呼吸条件下，是通过控制DCCD的量，使所有F₀F₁-ATP酶 分子上的F₀蛋白亚基都能结合上DCCD，使得电子传递产生的H⁺都滞留在膜外，测定此时 的pH变化即可准确反应细菌膜内外质子动力(pmf)，从而表征细菌厌氧呼吸过程中产生的 ATP的量。

本发明通过以下技术方案予以实现：

本发明所述的细菌厌氧呼吸过程中细菌膜内外质子动力(pmf)的测定方法，包括以下步 骤：

(a)将待测细菌培养至稳定生长期，收集菌体，去除培养基；

(b)配置反应液：在M9缓冲液的基础上添加待测细菌所需的单一电子供体和单一电子 受体，所述的M9缓冲液是含有5.7mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O，3.3mmol/L KH₂PO₄， 18.0mmol/LNH₄Cl的水溶液；

(c)确定加入反应液中DCCD的用量：